抗生素簡(jiǎn)介

抗生素(Antibiotic)，是指由微生物(包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬)或高等動(dòng)植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)，用于抑制微生物生長(zhǎng)或者殺死微生物，一般用來抑制感染。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中抗生素常常用于轉(zhuǎn)染抗性篩選。

轉(zhuǎn)染與抗性篩選

轉(zhuǎn)染(Transfection)是真核細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)導(dǎo)入外源核酸片段而獲得新表型的過程，引入的遺傳物質(zhì)(DNA和RNA)穩(wěn)定或暫時(shí)存在于細(xì)胞中，因此轉(zhuǎn)染可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（transient transfection）

外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平表達(dá)。遺傳物質(zhì)會(huì)因環(huán)境因素和細(xì)胞分裂而丟失，通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其他調(diào)控元件的分析。需要盡快在蛋白或基因水平進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（Stable transfected）

外源遺傳物質(zhì)既可以整合到宿主細(xì)胞基因組中，也可能作為一種游離體（episome）存在。引入的遺傳物質(zhì)帶有抗性基因，轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后通過選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。即使在宿主細(xì)胞分裂傳代后也能維持轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

想要長(zhǎng)期穩(wěn)定獲取某種重組蛋白以及需要長(zhǎng)期在某種細(xì)胞系中研究目的基因功能時(shí)，可以構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株來降低頻繁的轉(zhuǎn)染操作來降低實(shí)驗(yàn)成本。

如何篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株時(shí)可以把基因序列構(gòu)建在含有生物抗性基因的載體上(質(zhì)粒/慢病毒載體），重組載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞后通過抗性藥物持續(xù)篩選，未轉(zhuǎn)染進(jìn)質(zhì)粒的細(xì)胞因?yàn)椴荒鼙磉_(dá)抗性蛋白，在篩選過程中會(huì)被藥物殺死，剩下我們所需要的細(xì)胞。

常見的抗性篩選標(biāo)記

1、嘌呤霉素

嘌呤霉素是通過提前鏈終止，起到抑制蛋白合成的作用。但在嘌呤霉素-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶作用下，嘌呤霉素乙?；Щ?。

嘌呤霉素鹽酸鹽用來篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類型，培養(yǎng)基，生長(zhǎng)條件和細(xì)胞代謝率而變化，推薦使用濃度為0.1-10μg/ml。對(duì)于第一次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出最小致死濃度。

2、遺傳霉素（G418）

在分子遺傳實(shí)驗(yàn)中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的篩選試劑。G418和類似的抗生素能干擾核糖體功能，阻斷蛋白合成。含氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞，能將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式。

針對(duì)細(xì)胞系，通過建立細(xì)胞殺傷曲線，確定G418能殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最適濃度。篩選時(shí)，用不同濃度的G418處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，持續(xù)2～3周的培養(yǎng)篩選，通過肉眼觀察，或Giemsa或龍膽紫染色后進(jìn)行計(jì)數(shù)，選擇細(xì)胞存活數(shù)量最多的濃度。選擇最低濃度，是為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。推薦使用濃度為500-1000μg/ml。

3、潮霉素B

潮霉素B是吸水鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素，抑制細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成。潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶能使這個(gè)抗生素失效。和G418類似，針對(duì)第一次使用的細(xì)胞系建立細(xì)胞殺傷曲線，確定最適濃度。在含合適濃度的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。推薦使用濃度為50-1000μg/ml。

4、殺稻瘟菌素S

殺稻瘟菌素S是抗生素，通過阻斷氨酰-tRNA形成肽段，來抑制蛋白質(zhì)合成。攜帶bsr抗性基因或BSD抗性基因的細(xì)胞可編碼殺稻瘟菌素脫氨基酶，在含殺稻瘟菌素S條件下存活。

殺稻瘟菌素S用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的工作濃度為3～50ug/mL，需要針對(duì)每個(gè)細(xì)胞系測(cè)定最佳濃度。

5、鹽酸博萊霉素

鹽酸博來霉素是博來霉素/腐草霉素抗生素家族的一個(gè)成員，是從Streptomyces verticillus

中分離的水溶性、銅離子螯合糖蛋白抗生素，銅離子存在使得溶液呈藍(lán)色。這種銅離子螯合

形式是沒有活性的，當(dāng)抗生素進(jìn)入細(xì)胞后，Cu2+被還原成 Cu+，并被細(xì)胞中的巰基化合物除去。此時(shí)，鹽酸博來霉素才被活化并與 DNA 結(jié)合，對(duì) DNA 進(jìn)行切割，從而引起細(xì)胞死亡。而鹽酸博來霉素耐受基因（Sh ble）編碼的蛋白質(zhì)可以與鹽酸博來霉素結(jié)合，并抑制鹽酸博來霉素切割 DNA。

吉滿抗生素產(chǎn)品

吉滿可提供不同規(guī)格的嘌呤霉素鹽酸鹽、殺稻瘟菌素S(滅瘟素)Blasticidin S、遺傳霉素G418 Sulfate、潮霉素B(hygromycin B)等抗生素可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的抗性篩選。