簡(jiǎn)單介紹：免疫熒光技術(shù)正在免疫學(xué),生物化學(xué)與顯微鏡以技術(shù)為基礎(chǔ)的技術(shù)。它基于抗原抗體反應(yīng)的原理是先用熒光團(tuán)標(biāo)記已知的抗原或抗體，然后使用該熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)與定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）含量測(cè)定。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括細(xì)胞片制備,固定及通透（或稱為透化）,封閉,抗體孵育及熒光檢測(cè)等。細(xì)胞片制備（通俗的說法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的第一步，細(xì)胞片的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要，原因很簡(jiǎn)單，如果發(fā)生細(xì)胞掉片，一切都無從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片（Slides or Coverslips）的處理以及細(xì)胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定與通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑與固定程序?qū)τ讷@得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉與抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實(shí)驗(yàn)中要用到熒光抗體，因此必須謹(jǐn)記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

由于操作步驟比較多，同時(shí)在分析結(jié)果時(shí)無法像WB那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識(shí)別，所以要得到一個(gè)完美的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外，還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)對(duì)照?？傊?，免疫熒光實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞樣品處理,固定,封閉,抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程中每個(gè)步驟的質(zhì)量，才能最終達(dá)到你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

基本實(shí)驗(yàn)步驟：

（1）細(xì)胞制備。對(duì)于單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代中培養(yǎng)事先將細(xì)胞接種到帶有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中時(shí)，在細(xì)胞長(zhǎng)成單層后除去蓋玻片，并用PBS洗滌兩次;對(duì)于懸浮的生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，并使用PBS離心（1000rpm，5min）洗滌兩次，使用細(xì)胞離心片機(jī)制備細(xì)胞碎片或直接制備細(xì)胞涂片。

（2）固定的。根據(jù)需要選擇合適的固定劑來固定細(xì)胞。固定的細(xì)胞可以在含有疊氮化鈉的PBS中于4°C保存3個(gè)月。在PBS中洗滌3×5分鐘。

（3）透明。在添加抗體進(jìn)行孵育之前，通常需要先滲透用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定的細(xì)胞，以確保抗體可以到達(dá)抗原位點(diǎn)。滲透劑的選擇應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。滲透時(shí)間通常為5-15分鐘。滲透后，用PBS洗滌3×5分鐘。

（4）封閉。使用封閉液封閉細(xì)胞，時(shí)間一般為30min。

（5）一抗的組合。在室溫下孵育1h或在4°C過夜。用PBST沖洗3次，每次沖洗5分鐘。

（6）二抗結(jié)合。間接免疫熒光法需要使用二抗。在黑暗中于室溫下孵育1小時(shí)。用PBST沖洗3次，每次沖洗后用蒸餾水沖洗5分鐘。

（7）密封測(cè)試。加入一滴密封的片劑，裝入片劑，并用熒光顯微鏡檢查。

序列? ? ?產(chǎn)品名? ? ? ? ? ?貨號(hào)? ? ? ? ? ? ??CAS? ? ? ? ? ? ?備注

1? ? ? ? ??PBS? ? ? ? ? ?HC2031

2? ? ? ? ?PBST? ? ? ? ??HC0757

3? ? ??多聚甲醛? ? ? ??JT12020? ? ?30525-89-4

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?（一）細(xì)胞準(zhǔn)備

用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞可以是直接在蓋玻片上生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞，也可以是離心后被涂片的懸浮細(xì)胞，或者是通過離心從人體獲得的組織細(xì)胞懸浮液而被涂片的懸浮細(xì)胞。具有良好粘附性的細(xì)胞通常在培養(yǎng)過程中直接置于蓋玻片中，以使細(xì)胞在其上生長(zhǎng)。盡量避免將粘附性能差的細(xì)胞用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)，以免引起隨后的脫落操作而導(dǎo)致細(xì)胞脫落。一些實(shí)驗(yàn)需要使用這種細(xì)胞或懸浮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光觀察。建議使用細(xì)胞離心片機(jī)制備細(xì)胞碎片或直接制備細(xì)胞涂片。

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（二）固定與通透

研究細(xì)胞表面抗原或不穩(wěn)定的抗原可以不固定，一般應(yīng)固定。有三個(gè)固定目的：

①防止細(xì)胞從載玻片上脫落;

②清除阻礙抗原抗體混合脂質(zhì);

③使標(biāo)本易于保存。

?樣品的固定原理是：

①不能破壞細(xì)胞內(nèi)的抗原;

②不能凝集蛋白;

③應(yīng)保持細(xì)胞與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu);

④固定后應(yīng)保持通透性，以確保抗體可以自由進(jìn)入所有細(xì)胞，并且亞細(xì)胞成分與抗原結(jié)合。

常用的固定劑有多種，應(yīng)根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)與所使用的抗體特性選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌?。通常固定方法可以分為兩類：有機(jī)溶劑與交聯(lián)劑。有機(jī)溶劑如甲醇與丙酮等可去除類脂并使細(xì)胞脫水，同時(shí)將細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛通常通過自由氨基酸該基團(tuán)形成了一個(gè)分子間橋，形成了抗原相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。交聯(lián)劑比有機(jī)溶劑更易于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但由于交聯(lián)會(huì)阻礙抗體結(jié)合，因此可能會(huì)降低某些細(xì)胞成分的抗原性，因此需要一個(gè)滲透步驟以使抗體進(jìn)入樣品。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原產(chǎn)生的抗體可能在免疫熒光方面更有效。

最常用的固定劑有多聚甲醛與甲醇，少數(shù)情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進(jìn)行固定。通常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)抗原,病毒及一些酶類抗原使用丙酮,乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結(jié)果，而細(xì)胞膜相關(guān)組分抗原一般以多聚甲醛固定。細(xì)胞器與細(xì)胞顆粒內(nèi)的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要進(jìn)行通透以使抗體能達(dá)到抗原表位。

通透步驟只在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原表位的時(shí)候才需要，因?yàn)榭贵w需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部去檢測(cè)蛋白。但是，如果待檢測(cè)的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，則同樣需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透。相反，如果所檢測(cè)的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則不需要進(jìn)行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時(shí)是不需要通透的。甲醇同樣具有通透作用，但有些場(chǎng)合并不適合用甲醇，因?yàn)橐恍┍砦粚?duì)甲醇非常敏感。常用的通透劑是去垢劑，如Triton ,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 與 Leucoperm等。Triton與NP-40屬于烈性去垢劑，可部分溶解細(xì)胞核膜，因此非常適合核抗原檢測(cè)。但應(yīng)該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用時(shí)間過長(zhǎng)，它們將破壞蛋白，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Triton X-100是最常用的通透劑，但是它將破壞細(xì)胞膜，因此不適用于細(xì)胞膜相關(guān)抗原。后面一組去垢劑要溫與得多，它們可以在細(xì)胞質(zhì)膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會(huì)溶解細(xì)胞質(zhì)膜。適于胞質(zhì)抗原或者質(zhì)膜上靠近胞質(zhì)一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。

一般的操作程序是先固定后通透，但針對(duì)有些水不溶性的目的抗原的檢測(cè)宜先通透再固定，這樣做的原因主要是可以通過通透去除許多水溶性的蛋白，從而大大減少了免疫熒光的背景與非特異性信號(hào)。固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸餾水沖洗，防止自發(fā)性熒光。

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（3）封閉

封閉的目的是減少抗體非特異性結(jié)合，最常用的封閉劑是1％BSA，PBS pH 7.5，其他替代性封閉劑是1％明膠，1％?；蚺c第二抗體種類相同血清（3-10％）等

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?（4）抗體孵育

直接免疫熒光法中的一抗與間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體，因此在這些抗體孵育的時(shí)候必須注意避光。此外，為保證結(jié)合質(zhì)量與防止干燥抗體孵育應(yīng)盡可能在濕箱中進(jìn)行。

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（5）安裝和熒光觀察

標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片原則上可以直接進(jìn)行觀察，特別是有時(shí)候封片不當(dāng)反而使得前功盡棄。但在絕大多數(shù)情況下，為了保存結(jié)果，以便進(jìn)一步觀察,照像,統(tǒng)計(jì)分析等，需要密封。常規(guī)方法是使用甘油或中性樹脂進(jìn)行密封，為提高密封效果，經(jīng)常需要在密封過程中添加特殊的抗熒光淬滅劑。

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（6）標(biāo)本保存

由于熒光色素與蛋白分子的穩(wěn)定性都是相對(duì)的，因此隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，在各種條件影響下，標(biāo)記蛋白可能變性解離，失去其應(yīng)有的亮度與特異性。因此給標(biāo)本的保存帶來一定的困難，所以在標(biāo)本進(jìn)行熒光染色之后應(yīng)立即觀察。由于性能良好的抗熒光淬滅劑的出現(xiàn)，熒光標(biāo)記的標(biāo)本可以在低溫（4℃或-20℃）下保存相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。在某些情形下，考慮到實(shí)驗(yàn)的成本及實(shí)驗(yàn)條件，也可以采取權(quán)宜的辦法，比如固定標(biāo)本片后低溫保存，在需要時(shí)再進(jìn)行熒光標(biāo)記，即隨用隨染。