質(zhì)譜流式技術(shù)（Mass Cytometry）在藥物開發(fā)和生物藥物表征中的潛力巨大。質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)將質(zhì)譜技術(shù)與流式細(xì)胞儀相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)對單個細(xì)胞的生化成分進行深入研究，幫助我們理解疾病機制，驗證藥物的效果，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點以及增強生物制藥質(zhì)量控制。這在生物藥物表征中非常有用，它可以幫助解決以下一些問題：

單細(xì)胞層次的分子表征：傳統(tǒng)的質(zhì)譜技術(shù)通常需要大量的樣本以獲取可靠的結(jié)果，而質(zhì)譜流式技術(shù)則可以分析單個細(xì)胞的生化成分，這可以幫助我們更深入地理解細(xì)胞的生物學(xué)特性。

生物分子的定量分析：質(zhì)譜流式技術(shù)可以對細(xì)胞內(nèi)的生物分子進行定量分析，包括蛋白質(zhì)、代謝物和其他生物分子。

細(xì)胞異質(zhì)性的研究：細(xì)胞群體中的細(xì)胞并非完全相同，它們之間的差異可能影響疾病的發(fā)展和治療的效果。質(zhì)譜流式技術(shù)可以幫助我們研究這種細(xì)胞異質(zhì)性。

百泰派克生物科技BTP采用基于Fluidigm Helios流式細(xì)胞儀（Mass Cytometry System for Single Cell Analysis）用于單細(xì)胞質(zhì)譜分析，該平臺能夠完成包括單細(xì)胞捕獲、cDNA合成、實時定量PCR分析、目標(biāo)區(qū)域擴增以及質(zhì)譜流式細(xì)胞分析。

對于一個質(zhì)譜流式實驗，明確了實驗?zāi)康模_定實驗指標(biāo)，使用金屬標(biāo)簽標(biāo)記好的抗體之后，就可以進行樣品染色。

1. 單細(xì)胞懸液的制備

質(zhì)譜流式技術(shù)所需樣本為單細(xì)胞懸液，如果使用血液樣本，需要分離PBMC，如果使用組織樣本，則需要對組織進行解離。

1）外周血PBMC細(xì)胞的提取

推薦使用肝素或者檸檬酸鹽作為抗凝劑抽提全血，并在4小時內(nèi)使用Ficoll或者Percol密度梯度離心法分離出PBMC和粒細(xì)胞等，注意盡量去除紅細(xì)胞，檢測細(xì)胞活率后及時凍存（圖1）。

2）組織解離

不同文章或不同組織的解離方法不同，可以使用各個公司的組織解離試劑盒來進行實驗，或是參考文獻方法來進行實驗。組織解剖、酶消化和機械解離是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解和單細(xì)胞分離的三個重要步驟，評估固體組織酶促和機械解離后的三個關(guān)鍵參數(shù)是：1）細(xì)胞活力，2）沒有細(xì)胞碎片，3）沒有細(xì)胞聚集團塊（圖2）。

對于不同組織，使用的酶組合也有差異（圖3）。以膠原酶為例，膠原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離。用于消化組織中連接部分使其成為單個細(xì)胞，用于哺乳動細(xì)胞的分離；膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織；膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用于胰腺小島組織的分離，將結(jié)締組織分離成單個細(xì)胞；膠原酶Ⅱ適用于肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。

2018年發(fā)表的一篇對于單細(xì)胞RNA測序研究實驗設(shè)計的文章中，對于組織消化的處理進行了總結(jié)（圖4），可供參考。

也可以參考已發(fā)表的質(zhì)譜流式文章實驗步驟來設(shè)計實驗。

文章1：High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity.

手術(shù)切除后，在補充有20％胎牛血清（FCS）的IMDM + Glutamax培養(yǎng)基（Gibco）中收集腫瘤組織，腫瘤相關(guān)的淋巴結(jié)和結(jié)直腸健康黏膜。將樣品在培養(yǎng)皿中切成小片，并在5 mL IMDM + Glutamax培養(yǎng)基中用1 mg/mL膠原酶D（Roche Diagnostics）和50ug/ mL DNase I（Roche Diagnostics）酶解30分鐘。在溫和的MACS C管中（Miltenyi Biotec）。孵育期間和之后，將細(xì)胞懸液在gentleMACS Dissociator（Miltenyi Biotec）上機械解離。通過70 um細(xì)胞過濾器（Corning）過濾細(xì)胞懸浮液，并在IMDM + Glutamax培養(yǎng)基中洗滌。用Muse細(xì)胞分析儀（Merck）上的Muse計數(shù)和活力試劑盒（Merck）測定細(xì)胞數(shù)目和活力。

文章2：Systemic dysfunction and plasticity of the immune macroenvironment in cancer models.

小鼠吸入CO2安樂死后，通過后腔靜脈收集外周血，并轉(zhuǎn)移到肝素鈉包被的真空管中，然后在PBS中用5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.5％牛血清白蛋白（BSA）稀釋）（PBS/EDTA /BSA）。將脾臟和淋巴結(jié)在4°C的PBS / EDTA中勻漿。從股骨沖洗骨髓，并在4℃下重懸于PBS/EDTA中。將腫瘤切碎并在RPMI-1640中用1 mg ml -1膠原酶IV和0.1 mg ml -1消化DNaseI。消化后，將重懸的細(xì)胞用PBS/EDTA在4°C淬滅。將所有組織用PBS / EDTA洗滌，并用PBS/EDT和100 mM順鉑（Enzo Life Sciences）1：1懸浮60s，然后用PBS/EDTA/BSA 1：1淬滅以確定活力，如先前所述24。將細(xì)胞在4°C下以500 g離心5分鐘，然后以每毫升1×106至10×106個細(xì)胞的密度重懸于PBS/EDTA/BSA中。

文章3：A Single-Cell Atlas of the Tumor and Immune Ecosystem of Human Breast Cancer .

手術(shù)切除后，將新鮮組織樣品立即轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的MACS組織存儲溶液（Miltenyi Biotec）中，并在4°C下運輸。收集后24小時內(nèi)完成了組織處理。對于解離，使用手術(shù)刀將組織切碎，并根據(jù)制造商的說明，使用人的腫瘤解離試劑盒（Miltenyi Biotech）和gentleMACS Dissociator（Miltenyi Biotech）進一步分解。將所得的單細(xì)胞懸液依次通過無菌的70-um和40-um細(xì)胞過濾器過濾。

2. 細(xì)胞染色

1）細(xì)胞計數(shù)，順鉑染色

1、取不低于1×->IMG:http://file.biotech-pack.com/upload/xijia-file/image/analysis/word/20230530-6023-00136.png|個，用PBS重懸，將體積調(diào)至1 mL。

2、加入終濃度0.5 uM的Cell-ID Cisplatin，混勻后室溫放置2 min。

3、加入 2 mL Cell Staining Buffer 終止反應(yīng)，常溫300xg 離心5 min。

2）Fc blocking

單個人 PBMC 樣本:5 uL Fc Receptor Blocking Solution+50 uL CSB。

單個小鼠樣本:6.6 uL anti-CD16/32 抗體+48.4 uL Cell Staning Buffer)

3）表面抗體染色

配制一抗cocktail，單個樣品的抗體用量為 1.1uL，總體積 55 uL。

1、每管細(xì)胞加入 50 uL cocktail, 混勻，常溫放置30分鐘后。

2、加入2 mL Cell Staining Buffer，常溫 300xg 離心。重復(fù)一次。

4）固定和透化

1、在每個試管中加入1 mL Maxpar Fix I緩沖液，旋渦，室溫孵育10-30 min。

2、用2 mL Maxpar Perm-S緩沖液清洗細(xì)胞，

3、800 x g離心5 min，棄上清，重復(fù)一次。

5）胞內(nèi)抗體染色

1、在每管中加入50 uL的細(xì)胞質(zhì)/分泌抗體Cocktail。

2、輕輕混勻樣品，在室溫下孵育30 min。

3、孵育后每管加2 mL Maxpar Cell Staining Buffer洗滌，800xg離心5 min，棄上清。重復(fù)兩次洗滌。

6）DNA嵌入劑Ir染色

1、離心完成吸上清后，加入100 uL PBS，使細(xì)胞沉淀充分懸起。

2、加入1 mL cell intercalation溶液，立即吹勻，室溫1小時或4℃過夜。

7）細(xì)胞清洗，上機

1、細(xì)胞洗滌后，用CASbuffer重懸樣本，將細(xì)胞濃度調(diào)至1x10^6個/mL。

2、將樣本置于冰上，每個樣本上樣前，過30 um濾篩，補充1/10體積 beads。

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