肝細(xì)胞癌 (HCC) 是世界上最常見的人類惡性腫瘤之一，其中慢性肝臟炎癥是最大的誘因。大量研究表明，持續(xù)炎癥會(huì)引起肝細(xì)胞受損，如果受損細(xì)胞逃過免疫細(xì)胞的清除，則有可能進(jìn)一步發(fā)生癌變。然而這種利于腫瘤發(fā)生的免疫抑制微環(huán)境是如何形成的，目前研究較少。

2020年10月，香港大學(xué)馮奕斌教授團(tuán)隊(duì)在Hepatology（IF 14.679）雜志上發(fā)表題目為 《LOXL4 ?Fosters ?an ?Immunosuppressive ?Microenvironment ?During Hepatocarcinogenesis》的研究成果，報(bào)道了LOXL4蛋白在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的獨(dú)特作用，并通過Label free蛋白組發(fā)現(xiàn)了LOXL4在肝癌發(fā)生過程中促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境的分子機(jī)制。

研究材料：肝癌模型小鼠、骨髓來源的巨噬細(xì)胞、90對(duì)肝細(xì)胞癌患者的癌組織和癌旁組織

技術(shù)方法：Label free蛋白組

實(shí)驗(yàn)路線圖：

研究結(jié)果：

1、通過小鼠肝癌模型發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵蛋白LOXL4

賴氨酸氧化酶 (LOX) 家族的5個(gè)成員，即LOX和LOX-like (LOXL)蛋白1-4，是細(xì)胞外基質(zhì)中銅依賴性的單胺氧化酶，催化膠原蛋白和彈性蛋白的交聯(lián)。近年來的研究證實(shí)了LOX蛋白表達(dá)與腫瘤進(jìn)展的相關(guān)性，但其在介導(dǎo)肝癌發(fā)生中的功能作用尚不清楚。

研究者首先采用CDAA飲食 （缺乏膽堿和氨基酸） 和CCl4處理建立小鼠肝臟腫瘤模型，小鼠在處理1-3個(gè)月出現(xiàn)脂肪變性病癥，處理6個(gè)月發(fā)展為肝硬化，6-9個(gè)月進(jìn)展為肝癌。分析發(fā)現(xiàn)，只有LOXL4的mRNA水平在腫瘤發(fā)生期顯著升高，LOXL4蛋白也在病變肝組織中顯著升高。有趣的是，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中LOXL4蛋白免疫熒光信號(hào)較強(qiáng)，但在mRNA水平卻并未檢測(cè)到LOXL4的表達(dá)，作者推測(cè)，巨噬細(xì)胞可能通過外泌體吸收腫瘤細(xì)胞來源的LOXL4蛋白，WB雜交也證明了這一點(diǎn)。

2、LOXL4通過PD-L1塑造巨噬細(xì)胞免疫抑制來促進(jìn)腫瘤進(jìn)程

通過腺病毒條件敲低小鼠肝臟中LOXL4，與對(duì)照小鼠相比，LOXL4敲低小鼠每周腫瘤生長減慢，終點(diǎn)肝腫瘤體積和微血管密度降低。相反地，將rLOXL4（recombinant LOXL4 protein）腹腔注射到小鼠肝癌原位模型中，會(huì)導(dǎo)致腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中的LOXL4蛋白水平升高，并加速肝臟原位腫瘤生長。這表明LOXL4對(duì)腫瘤生長具有促進(jìn)作用。但如果注射藥物清除小鼠肝腫瘤的巨噬細(xì)胞，rLOXL4促進(jìn)腫瘤生長的作用變得不顯著，則說明LOXL4對(duì)腫瘤的促進(jìn)作用有賴于其對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用。

LOXL4對(duì)巨噬細(xì)胞有怎樣的影響呢？rLOXL4處理的巨噬細(xì)胞與CD8+?T細(xì)胞共培養(yǎng)顯著降低T細(xì)胞增殖，且阻斷了T細(xì)胞的激活，這證明LOXL4蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞具有免疫抑制能力。因此，作者進(jìn)一步分析了LOXL4對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)調(diào)控。結(jié)果表明，用rLOXL4處理巨噬細(xì)胞可顯著提高了PD-L1?mRNA的表達(dá)，表明LOXL4激活了PD-L1的轉(zhuǎn)錄。使用中和抗體阻斷rLOXL4處理的巨噬細(xì)胞中的PD-L1，可以恢復(fù)共培養(yǎng)T細(xì)胞的增殖和激活。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，rLOXL4處理降低了小鼠肝腫瘤中T細(xì)胞的數(shù)量，并削弱了T細(xì)胞的殺瘤作用。這些發(fā)現(xiàn)表明LOXL4對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫抑制作用依賴于PD-L1途徑。

3、蛋白組分析找到LOXL4調(diào)控免疫抑制的關(guān)鍵分子途徑

為了探究LOXL4調(diào)控巨噬細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的具體分子機(jī)制，研究者通過蛋白組學(xué)分析了巨噬細(xì)胞蛋白表達(dá)變化。Label free蛋白組篩選到大量差異蛋白，其中STAT1、STAT2、STAT3表達(dá)顯著上調(diào)。STAT1-STAT3的異二聚體可作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)含有IRE啟動(dòng)子元件的基因上調(diào)表達(dá)，而受此元件調(diào)控的基因大多具有免疫抑制作用。通過藥物抑制STAT3或STAT1活性，可導(dǎo)致LOXL4處理的巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄激活降低。

此外，通過富集分析顯示，與干擾素(IFNs)相關(guān)信號(hào)通路的基因受到LOXL4的正向調(diào)控。驗(yàn)證證實(shí)，巨噬細(xì)胞中大多數(shù)與IFN相關(guān)的基因都受到LOXL4的顯著調(diào)控。通過中和抗體阻斷IFN相關(guān)信號(hào)，降低了rLOXL4誘導(dǎo)的STAT3和STAT1激活。因此，rLOXL4誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)增加和轉(zhuǎn)錄激活也被IFNAR中和抗體削弱。

4、LOXL4的升高與HCC的不良預(yù)后相關(guān)

為了確定LOXL4與肝細(xì)胞癌的免疫狀況和臨床結(jié)局的關(guān)聯(lián)，研究者比較了90例病人肝癌組織和癌旁組織的LOXL4蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LOXL4蛋白表達(dá)在腫瘤中顯著增加。在肝癌組織中，LOXL4蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞中約70%為CD68+型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞， 且LOXL4+CD68+細(xì)胞數(shù)量顯著高于細(xì)胞數(shù)量LOXL4+CD68-細(xì)胞數(shù)量。分析發(fā)現(xiàn)CD68+型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中的LOXL4蛋白表達(dá)量與PD-L1的水平正相關(guān)。評(píng)估LOXL4表達(dá)與患者生存期的相關(guān)性表明，LOXL4和PD-L1雙低患者的總生存率高于雙高患者。LOXL4高表達(dá)可能預(yù)示著腫瘤免疫抑制性微環(huán)境，這也將引發(fā)不良臨床結(jié)局。

小編小結(jié)：

本研究圍繞LOXL4在肝癌中的功能做了深入研究，首先通過表型分析確定了LOXL4的促腫瘤作用，隨后證實(shí)其促腫瘤作用有賴于通過PD-1抑制巨噬細(xì)胞的免疫活性，進(jìn)而利用蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵蛋白STATs，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)LOXL4對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫抑制功能主要依賴于IFN介導(dǎo)的STATs依賴性的PD-L1活化。臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝癌CD68 +細(xì)胞中LOXL4蛋白表達(dá)量與PD-L1水平呈正相關(guān)，LOXL4的高表達(dá)和腫瘤組織中CD8A的低表達(dá)可共同預(yù)測(cè)HCC患者的不良生存。本研究揭示了LOXL4在肝癌發(fā)生過程中促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境形成的分子機(jī)理，也為肝癌防治提供了新的思路。

中科新生命蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)品線介紹

·?前中科院上海生科院蛋白質(zhì)研究分析中心，超過16年蛋白質(zhì)組分析與服務(wù)積累，提供各類樣本分析方案與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。

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