生物分離過程最終復(fù)習(xí)
名詞解釋：
反復(fù)凍融法：將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然后在室溫中融化。如此反復(fù)多次，就能使細(xì)胞壁破裂。凍結(jié)-融化法破壁的機(jī)制有兩方面：一方面在冷凍過程中會促使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能；另一方面，冷凍時胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。比較脆弱的菌體可采用此法，但釋放的蛋白質(zhì)僅為10%左右。
滲透壓沖擊法：先把細(xì)胞放在高滲溶液中（例如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)的水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮。當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓發(fā)生突然變化，胞外的水分迅速滲入胞內(nèi)，使細(xì)胞快速膨脹而破裂，使產(chǎn)物釋放到溶液中。
萃取：是將萃取劑和料液放在萃取器中，經(jīng)充分振蕩混合，靜置分層后形成萃取相和萃余相，用機(jī)械方法使互不相溶的兩相分開。
反萃取：反萃取是將萃取液與反萃取劑相接觸，使有機(jī)相中的溶質(zhì)轉(zhuǎn)入水相，可把這種過程看作是萃取的逆過程。反萃取后不含溶質(zhì)的有機(jī)相被稱為再生有機(jī)相，含有溶質(zhì)的水溶液被稱為反萃液。
有機(jī)溶劑沉淀：是指在蛋白質(zhì)溶液中，加入與水互溶的有機(jī)溶劑，能顯著地減小蛋白質(zhì)的溶解度而發(fā)生沉淀的方法。有機(jī)溶劑沉淀法常適用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖等物質(zhì)的提取。
晶種：是用于在結(jié)晶過程中誘導(dǎo)、加速結(jié)晶的一小部分已結(jié)晶的物質(zhì)。它是一種結(jié)晶的起始點(diǎn)，可以提供晶體結(jié)構(gòu)的模板，使溶液或熔融物中的溶質(zhì)分子圍繞晶種排列，形成新的晶體。
結(jié)晶：是指溶質(zhì)自動從過飽和溶液中析出形成新相的過程，結(jié)晶包括3個過程：形成過飽和溶液、晶核形成、晶體生長。
過飽和溶液：是指結(jié)晶過程中，溶質(zhì)濃度超過溶解度時，該溶液稱為過飽和溶液。過飽和溶液常用的形成方法：蒸發(fā)法、溫度誘導(dǎo)法、鹽析結(jié)晶法等。
物理吸附：是指吸附劑和吸附物之間通過分子間引力（如范德華力）而產(chǎn)生的吸附現(xiàn)象。
化學(xué)吸附：是指吸附劑和吸附物之間發(fā)生電子的轉(zhuǎn)移，因化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)鍵而吸附的現(xiàn)象。
吸附物：是指在物理或化學(xué)過程中，通過吸附作用將物質(zhì)從氣相或液相中吸附到固體表面上的物質(zhì)。
分離度：分離度又稱分辨率，是判斷物質(zhì)在色譜柱中的分離情況，常用分離度作為柱的總分離效能指標(biāo)。
脫鹽：是指將蛋白質(zhì)分離純化而將其他小分子鹽類除去的步驟，常用方法有：凝膠層析法、包埋法等。
離子交換法：是指利用溶液中各種帶電離子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異而進(jìn)行物質(zhì)分離的操作方法。
大孔型離子交換樹脂：又稱大網(wǎng)格離子交換樹脂，具有大孔結(jié)構(gòu)并帶有功能基團(tuán)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的不溶不熔聚合物，具有良好的耐磨強(qiáng)度和耐氧化、抗有機(jī)物污染的性能，可用于分離、提純等。
生物親和作用：生物物質(zhì)，特別是酶和抗體等活性物質(zhì)，具有識別特定物質(zhì)并與該物質(zhì)的分子相結(jié)合的能力，這種識別并結(jié)合的能力具有排他性，生物分子間的這種特異性相互作用稱為生物親和作用。
親和層析：是利用生物體中多數(shù)大分子物質(zhì)具有與某些相應(yīng)的分子專一性可逆結(jié)合的特性而建立的分離純化技術(shù)。
金屬離子親和層析：是利用金屬離子的絡(luò)合或形成螯合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離方法。
親和配基：是對生物分子具有專一性識別或特定的相互作用的基團(tuán)物質(zhì)。
相對離心力：是指離心力與重力的比值，表示離心機(jī)的離心能力。
沉降速度：是指在離心力的作用下，物質(zhì)粒子于單位時間內(nèi)沿離心力方向移動的距離。
沉降系數(shù)：是指在單位離心力場中，顆粒的沉降速度。
速度區(qū)帶離心法：又叫速率區(qū)帶離心法。離心操作時將樣品液置于連續(xù)或不連續(xù)線性或非線性密度梯度液上，控制離心時間，使所需組分穿過部分梯度液，形成的分離區(qū)帶在達(dá)到其等密度區(qū)之前即停止離心。
膜分離技術(shù)：是指用膜作為選擇障礙層，允許某些組分透過而保留混合物中其他成分，從而達(dá)到分離目的的技術(shù)。
透析：是通過小分子經(jīng)過半透膜擴(kuò)散到水（或緩沖液）的原理，將小分子與生物大分子分開的一種分離純化方法。
蛋白質(zhì)復(fù)性：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性程度不重時，可在消除變性因素條件下使蛋白質(zhì)恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。
簡答題：
1、凝聚和絮凝的區(qū)別？
（1）凝聚作用：是指在某些電解質(zhì)作用下，使膠體粒子的擴(kuò)散雙電層的排斥電位降低，破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒子聚集的過程。
影響凝聚作用的主要因素：無機(jī)鹽的種類、化合價以及無機(jī)鹽的用量等
常用的凝聚劑有：Al2(SO4)3·18H2O、AlCI3·6H20、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。
（2）絮凝作用：當(dāng)往膠體懸浮液中加入絮凝利時，膠?？蓮?qiáng)烈地吸附在絮凝劑表面的功能團(tuán)上，而且一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒的表面上，產(chǎn)生架橋聯(lián)接，形成粗大的絮凝團(tuán)沉淀出來，有助于過濾，這一過程稱為絮凝作用。
絮凝劑：根據(jù)所帶電性不同，可分為陰離子型、陽離子型和非離子型三類。
常用的絮凝劑：殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物及聚丙烯酸類等。
2、生物分離工程的特點(diǎn)是什么？
生物分離是從生物材料、微生物的發(fā)酵液、生物反應(yīng)液或動植物細(xì)胞的培養(yǎng)液中分離并純化有關(guān)產(chǎn)品（如具有藥理活性作用的蛋白質(zhì)等）的過程，又稱為下游加工過程。
生物工程的主要特點(diǎn)是：
（1）生物制品多種多樣，常無固定操作方法可循;生物材料組成非常復(fù)雜，。
（2）分離操作步驟多，不易獲得高收率，培養(yǎng)液（或發(fā)酵液）中所含目的物濃度很低，而雜質(zhì)含量卻很高
（3）分離進(jìn)程必須保護(hù)化合物的生理活性;
（4）生物活性成分離開生物體后，易變性、破壞。
3、單級萃取和多級錯流萃取的區(qū)別？
（1）單級萃?。?/strong>只包括一個混合器和一個分離器。料液和溶劑先經(jīng)混和器混合，達(dá)到平衡后，用分離器分離得到萃取液和萃余液。
（2）多級錯流萃取：料液經(jīng)萃取后的卒余液再用新鮮萃取劑進(jìn)行萃取的方法稱多級錯流萃取。
第一級的萃余液進(jìn)入第二級作為料液，并加人新鮮萃取劑進(jìn)行萃取，第二級的萃余液再作為第三級的料液，也同樣用新鮮萃取劑進(jìn)行萃取。同理還可進(jìn)行4級、5級以至n級萃取。
此法與單級萃取相比，溶劑消耗量大，而得到的萃取液平均濃度較稀，但萃取較完全。
4、什么是鹽析法？鹽析法的優(yōu)缺點(diǎn)？
鹽析法：是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引人定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法。
優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、不需特殊設(shè)備、操作簡便、安全、應(yīng)用范圍廣、較少引起變性（有時對生物分子具穩(wěn)定作用，至今仍廣泛用來回收或分離蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)）。
缺點(diǎn)：是沉淀物中含有大量鹽析劑，且硫酸銨易分解產(chǎn)生氨的惡臭味，產(chǎn)品不能直接用于醫(yī)藥上。
5、晶體的質(zhì)量指什么？如何提高晶體質(zhì)量？
晶體的質(zhì)量指的是晶體的物理和化學(xué)特性的質(zhì)量程度。晶體質(zhì)量的好壞反映了晶體制備的大小、形狀和純度三個方面。
提高晶體質(zhì)量的方法：
（1）改變晶體大?。?/strong>當(dāng)溶液快速冷卻時，能達(dá)到較高的過飽和度而得到較細(xì)小的晶體，反之緩慢冷卻常得到較大的晶體。當(dāng)溶液的溫度升高時，結(jié)晶器銅管的晶體成核速度和生長速度鈴增快，但后者的影響更顯著。
（2）改變晶體形狀：同種物質(zhì)的晶體，用不同的結(jié)晶方法產(chǎn)生，雖然仍屬于同一晶系，但其外形可以完全不同。外形的變化是因?yàn)樵谝粋€方向生長受阻，而在另一個方向生長加速所致。
（3）提高晶體純度：在結(jié)晶過程中，含許多雜質(zhì)的母液是影響產(chǎn)品純度的一個重要因素。晶體越細(xì)小，吸附雜質(zhì)越多。一股把晶體和溶劑一同放在離心機(jī)或過濾機(jī)中，攪拌后再離心或抽濾，這樣洗滌效果好。
6、大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑是什么？有哪些優(yōu)點(diǎn)？
大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑和大孔網(wǎng)狀離子交換樹脂具有相同的大網(wǎng)格骨架。其孔徑遠(yuǎn)大于2~4nm，可達(dá)到100nm甚至1000nm以上，故稱“大孔”。與大孔網(wǎng)狀離子交換樹脂相比，它不含離子交換樹脂的功能團(tuán)，僅保留了多孔的骨架，其性質(zhì)與活性炭、硅膠等吸附劑相似，稱為大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑。
優(yōu)點(diǎn)：與活性炭等經(jīng)典吸附劑相比，大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑具有選擇性好、解吸容易、理化性質(zhì)穩(wěn)定、機(jī)械強(qiáng)度好、可反復(fù)使用和流體吸力較小等優(yōu)點(diǎn)。特別是可通過不同的原料和合成條件改變其孔隙大小、骨架結(jié)構(gòu)和極性，因此適用于吸附各種有機(jī)化合物。
7、吸附法的定義，特點(diǎn)？
吸附法：指利用吸附作用，將樣品中的生物物活性物質(zhì)或雜質(zhì)吸附于適當(dāng)?shù)奈絼┥?，利用吸附劑對活性物質(zhì)和雜質(zhì)間吸附能力的差異，使目的物和其他物質(zhì)分離，達(dá)到濃縮和提純目的的方法。
主要特點(diǎn)：
（1）設(shè)備簡單、操作簡便、價廉、安全。
（2）少用或不用有機(jī)溶劑，吸附與洗脫過程中pH變化小，較少引起生物活性物質(zhì)的變性失活。
（3）天然吸附劑（特別是無機(jī)吸附劑）的吸附性能和吸附條件較難控制，吸附選擇性差，收率不高，難以連續(xù)操作。但是隨著人工合成的高聚物吸附劑的發(fā)展，其性能已有很一大改進(jìn)。
8、凝膠層析的原理與特點(diǎn)？
原理：凝膠層析的分離過程是在裝有多孔物質(zhì)填料的柱中進(jìn)行的，一個填料的顆粒含有許多不同大小的孔，這些孔對于溶劑分子來說是很大的，它們可以自由地?cái)U(kuò)散出入。如果對溶質(zhì)分子大小合適的話，則可以不同程度地往孔中擴(kuò)散，大個的溶質(zhì)分子只能占有比較少的孔，而小個的溶質(zhì)分子則除去能占有大孔外還可以占有另外一些較小的孔。所以溶質(zhì)分子尺寸的減小可以占有的孔體積迅速增加。當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過時，較小的分子在柱中停留時間比大分子停留的時間要長，于是樣品各組分即按分子大小順序而分開，最先流出的是最大的分子。
特點(diǎn)：
（1）凝膠層析操作簡便，所需設(shè)備簡單。
（2）分離效果較好，再復(fù)性高。
（3）分離條件緩和。
（4）應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類、激素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化
（5）分辨率不高，分離操作較慢。
9、凝膠層析的操作？每步操作中的關(guān)鍵點(diǎn)？
（1）樣品與上樣
關(guān)鍵點(diǎn)：樣品上柱
理想的樣品色帶應(yīng)是狹窄且平直的矩形色譜帶。為了做到這一點(diǎn)，應(yīng)盡量減少加樣品時樣品的稀釋以及樣品的非平流流經(jīng)層析凝膠床體。加樣時應(yīng)盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動?？梢灾苯訉悠芳拥綄游龃脖砻婊蚶脙煞N液體比重不同而分層的原理來實(shí)現(xiàn)。
（2）洗脫與收集
關(guān)鍵點(diǎn)：洗脫劑的流速
洗脫劑的流速對分離效果有很大影響，流速不宜過快且要穩(wěn)定。
（3）凝膠柱的再生
關(guān)鍵點(diǎn)：反沖
對流速下降的板結(jié)凝膠柱，最簡單的處理法是反沖，適當(dāng)?shù)姆礇_后往往可以恢復(fù)原來的流速。
10、離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)？離子交換樹脂的基本要求？
由三部分構(gòu)成：
（1）惰性的不溶性的高分子固定骨架，又稱載體
（2）與載體以共價鍵聯(lián)結(jié)的不能移動的活性基團(tuán)，又稱功能基團(tuán)
（3）與功能基團(tuán)以離子鍵聯(lián)結(jié)的可移動的活性離子，亦稱平衡離子。
基本要求：
（1）有盡可能大的交換容量
（2）有良好的交換選擇性
（3）化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定
（4）化學(xué)動力學(xué)性能好
（5）物理性能好
11、親和層析的原理？親和層析對載體的要求？
原理：是一種基于生物大分子之間的特異性相互作用原理進(jìn)行純化和分離的層析技術(shù)。它利用固定在色譜基質(zhì)上的配體與目標(biāo)生物分子之間的親和相互作用，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的選擇性捕獲和純化。
對載體的要求：
（1）載體必須能充分功能化，載體要具有足夠數(shù)量的功能基團(tuán)，或能方便地引入多個化學(xué)活性基因，以供與配基進(jìn)行共價連接之用。
（2）載體必須有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性，盡量減少非專一性吸附。
（3）載體必須具有高度的水不溶性和親水性。同時，親水性還有助于親和對達(dá)到親和平衡，并減少因疏水相互作用造成的非特異性吸附。
（4）載體應(yīng)具有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過。
（5）理想的親和層析載體外觀上應(yīng)為大小均勻的剛性小球，這樣在層析柱中才能保持良好的疏通。
12、等密度區(qū)帶離心法的原理，及特點(diǎn)？
原理：在離心力作用下，不同密度的多組分顆粒在梯度介質(zhì)中“向上”或“向下”移動，當(dāng)移動至其密度與介質(zhì)密度相等的位置便不再移動，形成靜止區(qū)帶，即“達(dá)到”離心平衡。區(qū)帶的位置即該組分的“等密度點(diǎn)”。
特點(diǎn)：
（1）加樣位置不均。
（2）離心平衡后，區(qū)帶的位置、形狀、不受離心時間影響。
（3）梯度的密度范圍應(yīng)包括樣品中所有組分顆粒之密度。
（4）分離依據(jù)是顆粒組分間“浮力密度”的差異，與顆粒大小，形狀無關(guān)。
（5）離心力大小，組分顆粒的大小和形狀，介質(zhì)密度梯度的斜率和形狀，黏度影響離心時間和分辨率（區(qū)帶寬度）。
計(jì)算題：
潔霉素在20℃和pH=10.0時表觀分配系數(shù)（丁醇/水）為18。用等量的丁醇萃取料液中的潔霉素，計(jì)算理論收率？若改用1/3體積丁醇萃取，計(jì)算理論收率？
（1）用等量的丁醇萃取料液中的潔霉素，理論收率：
萃余率：φ=萃余液中溶質(zhì)總量/原始料液中溶質(zhì)總量×100％=1/（E+1）×100％
理論收率：1-φ=E/E+1×100％=18/18+1×100％=94.7％
（2）改用1/3體積丁醇萃取，理論收率：
萃取相E=18×（1/3）/1=6
理論收率：1-φ=6/6+1×100％=85.7％
選擇題：
