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????????今天推薦的是由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院在2021年5月29日發(fā)表于Advanced Science （2020IF：16.807，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Han You教授，研究表明OTUD7B去泛素化LSD1以控制其結(jié)合伴侶蛋白的特異性、體內(nèi)平衡和乳腺癌轉(zhuǎn)移。

研究背景

????????在人類癌癥中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)OTUD7B的基因組擴(kuò)增。但它在腫瘤發(fā)生中的作用卻知之甚少。已知賴氨酸特異性去甲基化酶1 (LSD1) 通過與CoREST/組蛋白去乙?；?(HDAC) 形成抑制蛋白復(fù)合物來執(zhí)行表觀遺傳調(diào)控。然而，細(xì)胞維持LSD1/CoREST復(fù)合體完整性的分子機(jī)制尚不清楚。

摘要部分

????????LSD1蛋白經(jīng)歷K63連接的多泛素化。作者發(fā)現(xiàn)，OTUD7B負(fù)責(zé)K226/277殘基處的LSD1去泛素化，從而動(dòng)態(tài)控制LSD1結(jié)合伴侶蛋白的特異性和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。OTUD7B缺乏會(huì)增加LSD1與K63相關(guān)的泛素化，這會(huì)破壞LSD1/CoREST復(fù)合物的形成并靶向LSD1進(jìn)行p62介導(dǎo)的蛋白水解。因此，OTUD7B缺陷會(huì)損害全基因組LSD1并增強(qiáng)H3K4/H3K9的甲基化，從而深刻影響全基因表達(dá)并消除乳腺癌轉(zhuǎn)移。此外，OTUD7B的生理波動(dòng)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期依賴性LSD1振蕩，確保G1/S過渡。OTUD7B和LSD1蛋白在高級(jí)別或轉(zhuǎn)移性人類乳腺癌中都有過表達(dá)，而任何一種蛋白的失調(diào)都與不良的生存和轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，OTUD7B在維持LSD1/CoREST輔抑制因子復(fù)合物的完整性、LSD1周轉(zhuǎn)和乳腺癌轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著獨(dú)特的伴侶轉(zhuǎn)換作用。

研究內(nèi)容

1.OTUD7B結(jié)合LSD1并調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性??? ?

????????LSD1的異常表達(dá)已在人類癌癥中得到廣泛報(bào)道。然而，對(duì)來自癌癥基因組圖譜 (TCGA) 數(shù)據(jù)庫的檢查顯示，總體上突變率發(fā)生率非常低。大多數(shù)癌癥中其mRNA水平的變化，表明失調(diào)的LSD1信號(hào)主要是通過這種去甲基化酶的翻譯后修飾發(fā)生的。為了更深入地了解LSD1泛素化的生理調(diào)節(jié)，作者篩選了一個(gè)由 100 個(gè)已知或推定的DUB組成的DUB庫。除了USP22和USP28，異位OTUD7B也與內(nèi)源性LSD1結(jié)合牢固。與LSD1-CoREST復(fù)合物相比，內(nèi)源性O(shè)TUD7B-LSD1復(fù)合物易于檢測(cè)但豐度低得多，表明OTUD7B可能以瞬時(shí)方式與LSD1相互作用。OTUD7B和LSD1的核共定位通過免疫熒光 (IF) 染色進(jìn)一步驗(yàn)證。值得注意的是，當(dāng)OTUD7B和CoREST都異位表達(dá)時(shí)，作者無法檢測(cè)到兩者之間的任何顯著相互作用。使用重組蛋白，作者得出結(jié)論，OTUD7B可以在體外直接與LSD1相互作用。作者還注意到異位表達(dá)的 WT OTUD7B顯著增加了HEK293T細(xì)胞中的Flag-LSD1水平，而CI突變體卻沒有。相反，在幾種乳腺癌細(xì)胞系中消耗OTUD7B顯著降低LSD1蛋白水平，而不影響LSD1mRNA 表達(dá)。

????????作者接下來通過在缺失OTUD7B的MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)抗sgRNA的WT或突變體OTUD7B構(gòu)建體來產(chǎn)生OTUD7B重組細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)只有WT OTUD7B重組能拯救LSD1的減少，表明OTUD7B的DUB催化功能是其調(diào)節(jié)LSD1所需要的。蛋白酶體抑制劑硼替佐米 (BTZ) 在OTUD7B敲低后確實(shí)恢復(fù)了降低的LSD1水平。作者還觀察到在沒有OTUD7B的情況下LSD1的半衰期縮短，表明OTUD7B通過阻斷其蛋白酶體介導(dǎo)的降解來調(diào)節(jié)LSD1的穩(wěn)態(tài)。

研究結(jié)論：OTUD7B通過消除其泛素化依賴性蛋白酶體降解來結(jié)合并穩(wěn)定LSD1。

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2.OTUD7B是一種LSD1的去泛素化酶? ? ?

????????LSD1的泛素化已成為其周轉(zhuǎn)的重要調(diào)控機(jī)制。為了確定Ub連接的特異性，作者用Myc標(biāo)記的WT Ub或其變體之一（單個(gè)Lys-Arg替換七個(gè)賴氨酸殘基，即K6R、K11R、K27R、K29R、K33R、K48R 和K63R）轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。K63R 突變導(dǎo)致多泛素化LSD1信號(hào)的顯著丟失，而K48R顯示LSD1泛素化的非常微弱的減少，表明LSD1泛素化涉及混合連接的特異性，并且主要傾向于K63連接的聚泛素鏈。? ? ?

????????作者接下來確定OTUD7B是否調(diào)節(jié)了LSD1去泛素化。當(dāng)共轉(zhuǎn)染到 293T 細(xì)胞中時(shí)，只有 WT OTUD7B催化異位LSD1去泛素化。相反，OTUD7B敲低顯著增強(qiáng)了內(nèi)源性LSD1的多泛素化。另一方面，在表達(dá)K63R Ub突變體的細(xì)胞中，OTUD7B敲低未能增加LSD1泛素化?？傊@些數(shù)據(jù)表明OTUD7B是一種真正的LSD1去泛素化酶，可從LSD1中去除K63連接的多泛素化鏈。

????????Lys226 和 Lys277，是不同物種中的兩個(gè)保守賴氨酸殘基，為了進(jìn)一步證實(shí)這兩種賴氨酸在LSD1泛素化中的作用，作者通過用精氨酸替換賴氨酸構(gòu)建了雙取代突變體-LSD12KR（K226R/K277R）。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，與LSD1WT相比，LSD12KR幾乎完全抵抗異位OTUD7B催化的去泛素化，并且多泛素化LSD12KR的基礎(chǔ)水平也大大降低。為了探索K63連接的多聚Ub鏈在調(diào)節(jié)LSD1中的生理作用，作者通過敲除內(nèi)源性LSD1，然后重新引入Flag-LSD1WT或Flag-LSD12KR構(gòu)建體來生成LSD1重建的穩(wěn)定細(xì)胞系。與LSD1WT相比，LSD12KR不僅表現(xiàn)出顯著延長的半衰期，而且還賦予了對(duì)OTUD7B缺失誘導(dǎo)的多泛素化和降解的抗性。這些發(fā)現(xiàn)通過去除LSD1的K226和K277殘基上的K63連接的多聚Ub鏈，確定了OTUD7B在控制LSD1穩(wěn)態(tài)方面的關(guān)鍵作用。

研究結(jié)論：OTUD7B是一種真正的LSD1去泛素化酶。

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3.OTUD7B介導(dǎo)的LSD1上K63連接的多聚Ub鏈的去除決定了LSD1/CoREST/HDACs的完整性? ? ?

????????作為LSD1的關(guān)鍵結(jié)合伙伴，CoREST通過未知機(jī)制調(diào)節(jié)LSD1穩(wěn)定性。作者首先探究OTUD7B介導(dǎo)的LSD1穩(wěn)定是否需要CoREST。在OTUD7B缺陷細(xì)胞中，WT OTUD7B重建完全恢復(fù)了LSD1蛋白表達(dá)。然而，當(dāng)內(nèi)源性CoREST不存在時(shí)，這種恢復(fù)作用完全減弱。另一方面，單獨(dú)由CoREST缺失引發(fā)的LSD1不穩(wěn)定未能在CoREST和OTUD7B同時(shí)缺失后進(jìn)一步減少。結(jié)果顯示CoREST和OTUD7B可能通過相同的機(jī)制調(diào)節(jié)LSD1的穩(wěn)定性，特別是通過調(diào)節(jié)K63相關(guān)的LSD1泛素化。與OTUD7B缺失類似，CoREST的缺失導(dǎo)致LSD1的K63連接的多泛素化顯著增加。然而，在LSD1重建細(xì)胞中，LSD12KR僅對(duì)CoREST缺失引起的不穩(wěn)定表現(xiàn)出顯著的抵抗力。與這些觀察結(jié)果一致，LSD12KR重建細(xì)胞中的CoREST缺陷仍然能夠促進(jìn)LSD1的K63連接的泛素化。這些數(shù)據(jù)提出了CoREST可能通過阻止K226/277和其他殘基上的K63連接的LSD1多泛素化來調(diào)節(jié)LSD1穩(wěn)定性的可能性。

????????泛素化通常調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞過程。作者推測(cè)，LSD1的K63連接的多泛素化還可能會(huì)調(diào)節(jié)其與CoREST/HDACs復(fù)合物的關(guān)聯(lián)。作者檢查了敲低OTUD7B的細(xì)胞中的內(nèi)源性LSD1/CoREST/HDACs 復(fù)合物豐度。BTZ處理阻止了LSD1降解，但沒有恢復(fù)OTUD7B缺陷細(xì)胞中LSD1/CoREST/HDACs 復(fù)合物的數(shù)量，表明 K226/K277 殘基上的K63連接泛素化確實(shí)消除了LSD1與這些結(jié)合伙伴的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明OTUD7B介導(dǎo)的LSD1去泛素化與其對(duì)CoREST/HDACs 復(fù)合物的結(jié)合親和力之間存在因果關(guān)系。

研究結(jié)論：OTUD7B介導(dǎo)的LSD1上K63連接的多聚Ub鏈的去除決定了LSD1/CoREST/HDACs的完整性。

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4.LSD1的K63連接的多泛素化通過促進(jìn)與p62的相互作用促進(jìn)其蛋白酶體降解? ? ?

????????作者進(jìn)行了基于細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記 (SILAC) 定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以發(fā)現(xiàn)參與LSD1蛋白水解的潛在結(jié)合伙伴。在LSD1共免疫沉淀物中鑒定中，p62被證明是基于標(biāo)準(zhǔn)化SILAC比率的結(jié)合伙伴之一。p62已被證明優(yōu)先識(shí)別K63連接的多聚Ub鏈。作者發(fā)現(xiàn)，p62敲低完全減弱了由OTUD7B或CoREST丟失引發(fā)的LSD1降解。這些數(shù)據(jù)表明p62是LSD1的蛋白水解降解所必需的。

????????有趣的是，敲低OTUD7B或CoREST似乎顯著促進(jìn)了p62-LSD1復(fù)合物的形成。為此作者通過敲低內(nèi)源性p62然后回補(bǔ)抗shRNA的p62WT或p62F406V生成p62重建細(xì)胞。OTUD7B或CoREST敲低僅導(dǎo)致p62WT細(xì)胞中的LSD1降解，但不會(huì)導(dǎo)致p62F406V細(xì)胞中的LSD1降解，這表明與LSD1上的多聚Ub鏈的結(jié)合對(duì)于由OTUD7B或CoREST缺陷引發(fā)的p62介導(dǎo)的LSD1降解是必不可少的。LSD1的K63連接泛素化對(duì)p62表現(xiàn)出更強(qiáng)的結(jié)合親和力，表明K63連接的多聚Ub鏈在促進(jìn)LSD1-p62復(fù)合物形成中起關(guān)鍵作用。正如預(yù)期的那樣，只有WT p62與K63連接的LSD1相關(guān)，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了K63連接的多泛素化對(duì)促進(jìn)LSD1與p62相互作用的重要性。一致地，在LSD1重建細(xì)胞中，OTUD7B缺陷僅促進(jìn)p62與LSD1WT?的相互作用，但不促進(jìn)與LSD12KR的相互作用。在CoREST敲低后，在LSD1重建細(xì)胞中獲得了類似的結(jié)果。使用p62F406V重構(gòu)細(xì)胞，作者進(jìn)一步證實(shí)了LSD1對(duì)CoREST/HDAC 的結(jié)合能力在OTUD7B缺陷細(xì)胞中大大降低。

研究結(jié)論：LSD1的K63相關(guān)泛素化，由OTUD7B或CoREST的敲低觸發(fā)，通過p62將LSD1靶向蛋白酶體降解。

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5.OTUD7B對(duì)LSD1動(dòng)態(tài)變化的依賴性調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞周期的進(jìn)展至關(guān)重要

????????作者隨后研究OTUD7B-p62軸是否負(fù)責(zé)LSD1泛素化和整個(gè)細(xì)胞周期的降解。作者發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，OTUD7B沉默完全減弱了動(dòng)態(tài)LSD1波動(dòng)。此外，與表現(xiàn)出波動(dòng)表達(dá)模式的LSDWT水平不同，LSD12KR在整個(gè)細(xì)胞周期中保持不變。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈支持OTUD7B介導(dǎo)的LSD1去泛素化對(duì)其細(xì)胞周期依賴性波動(dòng)的生理影響。重要的是，p62敲低完全阻止了LSD1在釋放到G1階段后減少。總之，這些結(jié)果確立了K63相關(guān)的LSD1泛素化在細(xì)胞周期進(jìn)程中通過p62調(diào)節(jié)其周轉(zhuǎn)的關(guān)鍵作用。

????????作者推測(cè)K63相關(guān)的LSD1泛素化也可能在細(xì)胞周期中發(fā)生振蕩。事實(shí)上，在G2/M 同步的細(xì)胞中，K63連接的多泛素化LSD1大大減少，但一旦細(xì)胞進(jìn)入G1期，則顯著增加。使用表達(dá)WT-Ub構(gòu)建體的細(xì)胞獲得了類似的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明LSD1的K63連接的多泛素化的波動(dòng)動(dòng)態(tài)控制其在整個(gè)細(xì)胞周期中的穩(wěn)定性。鑒于細(xì)胞周期進(jìn)程中OTUD7B對(duì)LSD1的動(dòng)態(tài)和嚴(yán)格調(diào)節(jié)，作者接下來探究OTUD7B敲低是否會(huì)影響細(xì)胞周期。具有OTUD7B或LSD1敲低的細(xì)胞在同步后未能在G2/M停止。作者接下來檢查了LSD1重建細(xì)胞中OTUD7B敲低時(shí)的細(xì)胞周期分布。與LSD1WT重建相比，LSD12KR表現(xiàn)出對(duì)OTUD7B缺陷誘導(dǎo)的G1期停滯的抵抗力，表明K226/277處LSD1的K63連接多泛素化是G1/S過渡的決定因素。

研究結(jié)論：OTUD7B對(duì)LSD1波動(dòng)的依賴性調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞周期的進(jìn)展至關(guān)重要。

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6.OTUD7B以依賴LSD1的方式調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄? ? ?

????????由于OTUD7B調(diào)節(jié)LSD1/CoREST輔抑制因子復(fù)合物的完整性，作者推測(cè)OTUD7B可能影響LSD1的基因組占有率和H3K4me2修飾染色質(zhì)的富集。作者首先通過ChIP測(cè)序獲得LSD1染色質(zhì)分布模式的全局視圖，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)LSD1結(jié)合信號(hào)富集在MDA-MB-231細(xì)胞的內(nèi)含子或基因內(nèi)區(qū)域。在OTUD7B敲低后，43872個(gè)LSD1峰中約有16%顯示出LSD1信號(hào)的顯著丟失，這表明OTUD7B在調(diào)節(jié)整個(gè)基因組的LSD1結(jié)合中起著關(guān)鍵作用。

????????作者隨后在敲低OTUD7B或LSD1的MDA-MB-231細(xì)胞中進(jìn)行RNA-seq分析。LSD1和OTUD7B調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄組之間的重疊基因的通路分析顯示，大部分與“細(xì)胞周期”和“細(xì)胞分裂”相關(guān)。作者關(guān)注啟動(dòng)子在OTUD7B敲低后失去LSD1占據(jù)并獲得H3K4me2的基因。使用該標(biāo)準(zhǔn)，分別鑒定了258個(gè)OLco陰性和274個(gè)OLco陽性調(diào)節(jié)基因。共有11個(gè) OLco調(diào)控的基因與“腫瘤發(fā)生和細(xì)胞周期調(diào)控”相關(guān)。作者通過定量ChIP在OTUD7B敲低后觀察到LSD1結(jié)合信號(hào)的顯著喪失和 H3K4me2 標(biāo)記在這11個(gè)基因的啟動(dòng)子處的積累。作者還發(fā)現(xiàn)使用H3K9me2抗體的ChIP qPCR檢測(cè)在細(xì)胞周期蛋白D1、CDK6和snail啟動(dòng)子處檢測(cè)到H3K9me2信號(hào)急劇增加。因此，OTUD7B-LSD1軸的變化導(dǎo)致激活和抑制染色質(zhì)修飾標(biāo)記的變化，可能是OTUD7B缺失而改變的基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制。作者隨后分析了LSD1重建細(xì)胞中所選11個(gè)基因的LSD1結(jié)合和 H3K4me2/H3K9me2水平。對(duì)其mRNA水平的驗(yàn)證表明，與LSD1WT重建相比，LSD12KR?賦予對(duì)OTUD7B敲低誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)改變的抗性。此外，對(duì)于這些基因，其蛋白質(zhì)表達(dá)模式的變化與轉(zhuǎn)錄水平的變化非常一致。重要的是，在LSD1重建的細(xì)胞中，LSD12KR使它們的啟動(dòng)子對(duì)OTUD7B確實(shí)誘導(dǎo)的 H3K4me2/H3K9me2 改變具有抗性。這些結(jié)果突出了OTUD7B介導(dǎo)的LSD1去泛素化在調(diào)節(jié)其基因組占有率和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的關(guān)鍵作用。

研究結(jié)論：OTUD7B以依賴LSD1的方式調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。

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7.OTUD7B通過LSD1促進(jìn)轉(zhuǎn)移? ? ?

????????LSD1與促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)。作者接下來進(jìn)行了脂肪墊注射，然后進(jìn)行了定量生物發(fā)光成像分析。與LSD1敲低類似，OTUD7B敲低顯著損害了LM2細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。同樣，當(dāng)OTUD7B缺失時(shí)，LSD12KR細(xì)胞賦予對(duì)轉(zhuǎn)移潛能喪失的抵抗。作者接下來探討了OTUD7B-LSD1信號(hào)傳導(dǎo)的臨床意義。在人類癌癥中發(fā)現(xiàn)了增加的OTUD7B轉(zhuǎn)錄水平。免疫組織化學(xué) (IHC) 染色檢測(cè)到405例乳腺癌樣本中OTUD7B和LSD1的蛋白表達(dá)顯著升高，與其組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)。

????????這些觀察結(jié)果促使作者探索基于OTUD7B/LSD1介導(dǎo)的基因表達(dá)特征促進(jìn)轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路的富集。為此，作者利用來自人類癌癥轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)庫（HCMDB）的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）。使用OLco調(diào)節(jié)的基因集顯示，OTUD7B或LSD1的缺失導(dǎo)致轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)顯著降低解釋了由于OTUD7B-LSD1信號(hào)傳導(dǎo)受損而抑制轉(zhuǎn)移能力。該結(jié)果還表明，這些蛋白質(zhì)的異常高表達(dá)水平可能對(duì)乳腺癌患者的腫瘤分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有預(yù)后意義。在 277名患者的隊(duì)列中，OTUD7B和LSD1的IHC染色顯示這兩種蛋白質(zhì)在基底樣亞型中的染色強(qiáng)度要強(qiáng)得多。對(duì)來自METABRIC的已發(fā)表基因組數(shù)據(jù)的進(jìn)一步檢查顯示，與其他亞型 (273/1399) 相比，基底樣亞型中OTUD7B(57/209) 拷貝數(shù)增加的頻率顯著增加。與這一發(fā)現(xiàn)一致，具有高OTUD7B表達(dá)的基底樣乳腺癌患者的生存率較低，表明異常的OTUD7B表達(dá)可能是基底樣乳腺癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)中潛在有用的生物標(biāo)志物。

研究結(jié)論：OTUD7B通過去泛素化LSD1促進(jìn)轉(zhuǎn)移，另一方面失調(diào)的OTUD7B/LSD1軸的臨床相關(guān)性，這可能作為乳腺癌患者生存結(jié)果不佳的潛在預(yù)后標(biāo)志物。

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結(jié)論與討論

????????在這里，作者發(fā)現(xiàn)OTUD7B，一種屬于DUB的卵巢腫瘤(OTU)家族的去泛素化酶，負(fù)責(zé)LSD1去泛素化。據(jù)報(bào)道，OTUD7B催化包括細(xì)胞周期蛋白B、極光A、表皮生長因子受體(EGFR )、Sox2、Zap70和TRAF3。OTUD7B的基因組擴(kuò)增在人類癌癥中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)。但人們對(duì)這種去泛素化酶在腫瘤發(fā)生中的作用知之甚少。作者的數(shù)據(jù)揭示了OTUD7B通過調(diào)節(jié)LSD1穩(wěn)定性及其組裝成輔抑制因子復(fù)合物在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖和癌癥轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用。

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Thank you!

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原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34050636/