鼻咽癌（NPC）發(fā)生于鼻咽部，是一種起源于鼻咽上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其發(fā)生主要與遺傳因素、EB病毒感染和環(huán)境因素有關(guān)。放眼全球，NPC的發(fā)病率極不均衡，具有明顯的區(qū)域聚集性和種族偏好性，多發(fā)于東亞和東南亞，尤其是我國南方[1]。然而，NPC的具體病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，仍待進(jìn)一步研究。

環(huán)狀RNA（circRNA）具有種類豐富、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、序列保守以及組織特異性表達(dá)等特點(diǎn)，且在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。有學(xué)者利用高通量測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)，在NPC細(xì)胞中鑒定出了數(shù)個(gè)獨(dú)特的circRNA，發(fā)現(xiàn)它們?cè)贜PC細(xì)胞和正常細(xì)胞之間具有顯著差異表達(dá)，表明circRNA可以作為潛在的臨床診斷和預(yù)后指標(biāo)[2]。然而，circRNA在NPC中的潛在機(jī)制仍然未知。

2023年5月12日，中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所向波研究員團(tuán)隊(duì)在Nature集團(tuán)旗下期刊Cell Death & Differentiation發(fā)表文章Circular RNA circRILPL1 promotes nasopharyngeal?carcinoma malignant progression by activating the?Hippo-YAP signaling pathway。作者在鼻咽癌細(xì)胞中鑒定到一個(gè)新的環(huán)狀RNA——circRILPL1。它可以結(jié)合并激活ROCK1以抑制LATS1激酶，從而抑制LATS1對(duì)YAP的磷酸化過程，并且增強(qiáng)YAP活性。同時(shí)，circRILPL1通過增強(qiáng)YAP與核轉(zhuǎn)運(yùn)受體IPO7之間的相互作用，促進(jìn)YAP易位進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，活化的YAP會(huì)促進(jìn)CAPN2和PXN的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。此外，circRILPL1在體內(nèi)外均能促進(jìn)NPC的增殖和轉(zhuǎn)移。文章解析了環(huán)狀RNA在鼻咽癌細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)作用，揭示環(huán)狀RNA circRILPL1通過激活Hippo-YAP信號(hào)通路調(diào)控鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制。

circRILPL1在鼻咽癌組織中高表達(dá)，并與鼻咽癌患者預(yù)后不良相關(guān)

首先，作者在GEO數(shù)據(jù)庫中搜索并分析NPC的RNA-seq數(shù)據(jù)，確定了30個(gè)在NPC組織中高表達(dá)的circRNA，其中circRILPL1為首次發(fā)現(xiàn)。qRT-PCR和ISH結(jié)果顯示，circRILPL1在NPC中的表達(dá)量顯著高于非癌性鼻咽上皮組織組別。此外，作者分析Kaplan-Meier曲線發(fā)現(xiàn)，circRILPL1高表達(dá)對(duì)NPC患者預(yù)后差，而circRILPL1低表達(dá)的NPC患者預(yù)后較好。接著，通過核質(zhì)分離定量實(shí)驗(yàn)和FISH實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)circRILPL1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布。綜上表明，circRILPL1是一個(gè)在NPC中高表達(dá)的新環(huán)狀RNA，可能在NPC的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。

circRILPL1在體外和體內(nèi)均促進(jìn)NPC細(xì)胞的增殖和遷移

作者通過劃痕和transwell實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circRILPL1可以顯著增強(qiáng)NPC細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)circRILPL1會(huì)促進(jìn)NPC細(xì)胞的增殖，而敲低circRILPL1后獲得了相反的結(jié)果。結(jié)合皮下腫瘤模型和IHC數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，circRILPL1過表達(dá)組的腫瘤體積和重量顯著增加且Ki67的表達(dá)量較高，而circRILPL1敲低組的結(jié)果相反，表明circRILPL1促進(jìn)了小鼠NPC細(xì)胞的生長。綜合尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型和裸鼠腳墊淋巴轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，過表達(dá)circRILPL1會(huì)促進(jìn)小鼠NPC細(xì)胞發(fā)生肺轉(zhuǎn)移和腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而circRILPL1敲低組的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移較少。綜上表明，過表達(dá)circRILPL1在體外和體內(nèi)均促進(jìn)了NPC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

circRILPL1激活Hippo-YAP信號(hào)通路

作者利用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)過表達(dá)circRILPL1的NPC細(xì)胞系進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果顯示Hippo信號(hào)通路中有11種蛋白質(zhì)被富集。通過WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Hippo信號(hào)通路中的核心蛋白YAP（Ser127和Ser397）和LATS1的磷酸化會(huì)因circRILPL1的過表達(dá)或敲低而受到調(diào)節(jié)，而MST1沒有顯著變化。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，過表達(dá)circRILPL1顯著增強(qiáng)了YAP的轉(zhuǎn)錄活性，而敲低circRILPL1則產(chǎn)生了相反的結(jié)果。此外，作者通過劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)YAP可以逆轉(zhuǎn)circRILPL1敲低對(duì)NPC細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。而且，MTT和克隆形成測(cè)定結(jié)果顯示，過表達(dá)YAP逆轉(zhuǎn)了circRILPL1敲低對(duì)NPC細(xì)胞增殖的抑制作用。總之，circRILPL1在NPC細(xì)胞中的功能依賴于YAP信號(hào)通路的激活。

circRILPL1與ROCK1結(jié)合，抑制LATS1-YAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)

為了探索circRILPL1調(diào)節(jié)Hippo-YAP信號(hào)通路的機(jī)制，作者通過質(zhì)譜法鑒定RNA pull-down產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)circRILPL1不直接結(jié)合LATS1或YAP，但與ROCK1結(jié)合。接著，作者用RNA pull-down和RIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)合IF-FISH的共定位結(jié)果，證實(shí)了circRILPL1與ROCK1互作。WB結(jié)果顯示，在過表達(dá)circRILPL1的NPC細(xì)胞中利用siRNA敲低ROCK1的表達(dá)水平，顯著抑制了LATS1的去磷酸化，從而抑制了YAP去磷酸化并導(dǎo)致YAP蛋白水平顯著降低，表明circRILPL1與ROCK1互作在LATS1-YAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

circRILPL1與IPO7結(jié)合，促進(jìn)YAP蛋白發(fā)生核易位

作者在與circRILPL1結(jié)合的pull-down產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了一種核轉(zhuǎn)運(yùn)受體IPO7，并且用RNA pull-down、RIP和IF-FISH證實(shí)了circRILPL1和IPO7之間存在相互作用。通過核質(zhì)分離定量分析，結(jié)合免疫熒光結(jié)果，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circRILPL1能誘導(dǎo)IPO7進(jìn)入細(xì)胞核，而敲低circRILPL1則減少了IPO7入核。IP和免疫熒光結(jié)果顯示，過表達(dá)circRILPL1使IPO7和YAP之間的結(jié)合顯著增強(qiáng)。綜上表明，circRILPL1介導(dǎo)了IPO7和YAP之間的結(jié)合。WB結(jié)果顯示，敲低IPO7會(huì)阻礙circRILPL1誘導(dǎo)YAP從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核，并抑制YAP轉(zhuǎn)錄活性，表明circRILPL1在一定程度上依賴于IPO7蛋白誘導(dǎo)YAP核易位。

circRILPL1-YAP信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)CAPN2和PXN的轉(zhuǎn)錄

作者分析circRILPL1過表達(dá)后的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)circRILPL1-YAP信號(hào)傳導(dǎo)通路能激活在細(xì)胞遷移和侵襲中起重要作用的基因CAPN2和PXN。此外，qRT-PCR和WB結(jié)果證實(shí)了circRILPL1可以使NPC細(xì)胞中CAPN2和PXN的mRNA表達(dá)和蛋白水平上調(diào)。過表達(dá)YAP促進(jìn)了CAPN2和PXN的轉(zhuǎn)錄，而敲低YAP抑制其轉(zhuǎn)錄。而且，過表達(dá)YAP能逆轉(zhuǎn)由circRILPL1敲低引起的CAPN2和PXN轉(zhuǎn)錄水平降低。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)circRILPL1促使YAP富集在CAPN2和PXN啟動(dòng)子區(qū)域。綜上表明，circRILPL1通過激活YAP來促進(jìn)CAPN2和PXN的轉(zhuǎn)錄。

總結(jié)：

circRILPL1通過結(jié)合并激活ROCK1來抑制LATS1激酶，從而抑制YAP的磷酸化；circRILPL1與核轉(zhuǎn)運(yùn)受體IPO7互作，使YAP與IPO7結(jié)合，從而增強(qiáng)YAP核易位；而YAP可以激活CAPN2和PXN的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。總的來說，circRILPL1通過結(jié)合ROCK1和IPO7，協(xié)同調(diào)節(jié)YAP的激活及其核易位，誘導(dǎo)NPC細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移和侵襲，在鼻咽癌腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵的致癌作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chen, Y.P., et al., Nasopharyngeal carcinoma. Lancet, 2019. 394(10192): p. 64-80.

[2] Zhou, D.N., et al., Integrated analysis of transcriptome profiling predicts potential lncRNA and

circRNA targets in human nasopharyngeal carcinoma. Oncol Lett, 2020. 19(4): p.?3123-3136.

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41418-023-01171-8