梯度洗脫程序如何設(shè)置？

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本次課程本身可能并不嚴(yán)謹(jǐn)，只是提供一個(gè)思路，不是萬能公式或者套路。請注意使用條件，切勿盲目套用。雖然限制比較多，但是大家也不要太多顧慮，因?yàn)榇蟛糠侄际强梢灾苯佑玫摹?/strong>

（應(yīng)對不同的檢測器、不同色譜等情況，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整解決方案）

梯度洗脫在反相色譜應(yīng)用比較廣泛，正相也有。我們以反相色譜，普通C18為例。

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上節(jié)課，我們知道調(diào)整保留時(shí)間可以通過改變流動(dòng)相比例來實(shí)現(xiàn)。

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請記住以下知識點(diǎn)：（這不是定理，少數(shù)情況可能并不成立）

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1.在反相色譜中，有機(jī)相（甲醇、乙腈等）比例越高出峰越快（早）

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2.待測物在色譜柱保留的時(shí)間越長，和雜質(zhì)分離效果越好

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3.出峰時(shí)間越早，峰形越對稱尖銳；出峰時(shí)間越晚，峰形會(huì)變寬。因此，讓待測物和雜質(zhì)分離，就要讓待測物出峰變慢，然后峰形會(huì)隨之變差。所以，這與第二個(gè)點(diǎn)是矛盾的，不是讓出峰時(shí)間越晚就越好。

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4.流動(dòng)相變化速率越大，那么基線越不平穩(wěn)。與基線相關(guān)的主要因素有：檢測波長（熒光和紫外）、流動(dòng)相、流動(dòng)相變化速率（儀器條件）、色譜柱（不同品牌、不同規(guī)格）。

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梯度洗脫要解決的問題（依據(jù)重要程度排序）

1.? 實(shí)現(xiàn)峰的分離

2.? 控制出峰時(shí)間

3.? 基線平穩(wěn)（只要不影響定量就可以，不要多度追求完全平的基線。）

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現(xiàn)實(shí)情況復(fù)雜多變，我希望大家先花費(fèi)一些時(shí)間熟悉自己要做的東西，尤其是一些標(biāo)液需要衍生之后才能檢測的情況。比如什么先跑單標(biāo)確定出峰時(shí)間，記錄一下光譜圖?；鞓?biāo)出峰的數(shù)量，能夠分辨出那個(gè)峰是什么物質(zhì)等等，當(dāng)然是越熟悉越好，這樣去優(yōu)化才會(huì)更得心應(yīng)手一些。如果連這些最基本的都不清楚，就別一上來就摸索梯度程序。

運(yùn)用實(shí)例

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8種色素標(biāo)準(zhǔn)的梯度分離方法是如何優(yōu)化出來的

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1.學(xué)會(huì)如何計(jì)算

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注意，改變流動(dòng)相或者更換色譜柱都要從頭開始對梯度進(jìn)行優(yōu)化，改變流動(dòng)相PH就等同于換了流動(dòng)相。

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使用如下方法進(jìn)行數(shù)據(jù)采集：

第一、是用方法得出如下參數(shù)。

初始比例???? 5

最終比例???? 100

結(jié)束時(shí)間???? 20

第一個(gè)峰保留時(shí)間?? 6.128

最后一個(gè)峰保留時(shí)間?? 19.271

流動(dòng)相變化速率?? 4.75?? 用字母S表示

流速?? 1.0

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第二、根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算，得出第一版的梯度方法。

F（x）=2.375x2+5x??? ?f(x)=4.75x+5

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第一個(gè)峰和第二個(gè)峰分離不是很開，7min之后出比較好。

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最后一個(gè)峰出峰時(shí)間如何確定比較好？

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峰寬，峰間隔，峰數(shù)量。（理想情況如下）

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從譜圖可以看出，兩個(gè)峰相差1.2min的時(shí)候，分離度比較好，那8個(gè)峰，每個(gè)峰之間的距離是1.2，那第一峰和最后一個(gè)峰保留時(shí)間之差為7×1.2=8.4min以上就可以很好平均每個(gè)峰。

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通過F（x）=2.375x2+5x計(jì)算出第一個(gè)峰出峰需要用到的有機(jī)相體積 119.827

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我要第一個(gè)峰出峰時(shí)間為7min，初始比例不改變，仍然為5，那么代入F（x）=S/2×x2+5x，則119.827=S/2×72+5×7? 可以算出流動(dòng)相變化速率S≈3.46

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代入f(x)=3.46x+5? 得出7min時(shí)，有機(jī)相比例為3.46×7+5=29.2%

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通過F（x）=2.375x2+5x計(jì)算出最后一個(gè)峰出峰需要用到的有機(jī)相體積??? 978.362

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我要最后一個(gè)峰出峰時(shí)間是16 min 此時(shí)，需要代入計(jì)算的X=（16-7）min=9 min

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有機(jī)相體積為 978.362-119.827=858.535?? 那么代入F（x）=S/2×x2+29.2x，則858.535 =S/2×92+29.2×9? 可以算出流動(dòng)相變化速率S≈14.71

代入f(x)=14.71x+29.2? 得出16 min時(shí)，有機(jī)相比例為14.71×9+29.2=161.58%＞100%

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說明16 min,最后一個(gè)峰出不來。

然后進(jìn)樣，得出混標(biāo)的出峰圖譜。

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公式的由來：在同一根色譜柱，同一種流動(dòng)相，不考慮柱流失和因外部因素導(dǎo)致的壓力變化的情況下，同一個(gè)物質(zhì)出峰所消耗的有機(jī)相體積應(yīng)該是近似相等的。

計(jì)算前后的梯度程序?qū)Ρ葓D如下：

計(jì)算的缺陷

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復(fù)雜梯度

F（x）就比較復(fù)雜，計(jì)算困難，可以運(yùn)用變化速率，簡單替代進(jìn)行計(jì)算。或者直接運(yùn)用經(jīng)驗(yàn)。

2.根據(jù)出峰時(shí)間進(jìn)行分組，然后進(jìn)行微調(diào)。

分組的規(guī)則：依據(jù)出峰順序和接近程度進(jìn)行分組。不要單純的用峰的數(shù)量來平均分組。

????????

如何微調(diào)？

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流動(dòng)相變化速率S =比例之差÷時(shí)間之差

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按照分組進(jìn)行處理，從前到后，依次進(jìn)行。

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首先，進(jìn)行圖譜對應(yīng)

3.微調(diào)結(jié)束，增加恢復(fù)初始濃度的梯度設(shè)置。

1.? 為什么要驗(yàn)證？

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因?yàn)橛行┝鲃?dòng)相色譜柱平衡需要比較長的時(shí)間，這樣會(huì)導(dǎo)致這一針的圖是OK的，下一針的圖又突然不行了。如果方法比較成熟，那么換色譜柱，換儀器，不同的時(shí)間，不同的人，都是可以重復(fù)出你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的。

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優(yōu)化對比圖，說出下面兩個(gè)圖怎樣可以更好。

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進(jìn)階

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如何判斷需要更換流動(dòng)相或者色譜柱？

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第一、弱保留

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普通C18測有機(jī)酸，最明顯。2%甲醇增加到2.5%的甲醇，出峰時(shí)間提前了一倍。也就是我們常說的弱保留。（當(dāng)然這是比較極端的情況。所以有機(jī)酸都用親水性比較強(qiáng)的柱子去做，流動(dòng)相也是高鹽或者較強(qiáng)的酸。如0.1%磷酸。）

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第二、分不開

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無論如何調(diào)整比例，甚至使用等度，兩個(gè)峰出峰時(shí)間過早或者過晚，都是黏在一起。更換流動(dòng)相之后測試仍然是這種情況，就只能更換適合分離這類物質(zhì)的色譜柱了。

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第三、峰形差

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這種情況不是特別常見，本身等度的時(shí)候峰形是正常的，換成梯度洗脫，然后實(shí)現(xiàn)峰的分離之后，有個(gè)別峰的峰形就變得不堪入目。如果對于圖譜要求比較高的話，這種情況也只能更換流動(dòng)相或者色譜柱了。

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合適的梯度比例，可以減少溶劑消耗，有時(shí)一些看似差別不大的數(shù)據(jù)，放在一定條件下，可能會(huì)產(chǎn)生很大的影響，失之毫厘謬以千里。科研的道路更需要嚴(yán)謹(jǐn)和系統(tǒng)治學(xué)方法。

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