CUT&Tag技術的簡介

眾所周知，染色質免疫沉淀（ChIP）是分析轉錄因子和輔因子與DNA的結合以及組蛋白和組蛋白修飾在整個基因組中的定位的金標準技術。但是該技術步驟繁瑣，耗時長，需要的起始樣本量很高，而很多研究很難獲得足夠量的樣本開展該實驗。隨著二代測序技術的發(fā)展，ChIP-seq提高了數(shù)據(jù)的解讀通量，但是ChIP技術本身的核心方法自提出至今近30年并沒有根本的改進。

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是替換傳統(tǒng)的ChIP-Seq來研究蛋白質-DNA互作的新技術。與ChIP相同的是都需要利用抗體識別并結合目標蛋白，不同點在于CUT&Tag技術利用Tn5轉座酶與Protein A/G的融合蛋白，把酶引導至與目標染色質結合的抗體。Tn5轉座酶預先加上adapter，形成組裝的pA/G-Tn5轉座體，Tn5可以直接剪切染色質進行文庫制備。而所使用的抗體可以特異性靶向特定蛋白，因此所得到的結果可以揭示特定位點或蛋白質結合位置的染色質信息。與ChIP-seq相比，CUT&Tag具有顯著優(yōu)勢，如：信噪比高，可重復性好，實驗周期短（1天實現(xiàn)從細胞到文庫構建），細胞投入量低等，尤其適用于早期胚胎發(fā)育、干細胞、腫瘤以及表觀遺傳學等研究領域。

圖1 | CUT&Tag實驗流程圖

CUT&Tag技術的應用

自從2019年CUT&Tag技術出現(xiàn)，迄今為止已經有多篇論文應用該技術進行組蛋白、轉錄因子功能研究。例如在擬南芥雄配子發(fā)育過程中，H3K27甲基化狀態(tài)的改變可以影響雄配子體中兩個細胞系的命運。H3K27me3通常在含有沉默基因的染色質區(qū)域富集。研究人員通過CUT&Tag技術發(fā)現(xiàn)擬南芥雄配子中的營養(yǎng)細胞有6950個H3K27me3峰，而精子細胞有694個H3K27me3峰，這一結果表明精子細胞中缺少H3K27me3，這一結果與之前的ChIP-Seq研究結果一致。

Runt相關轉錄因子2（RUNX2）是一種與成骨相關的轉錄因子，在癌變過程中是一種重要的轉錄抑制因子。我國學者研究發(fā)現(xiàn)，該轉錄因子與乳腺癌轉移密切相關。文章通過CUT&Tag技術發(fā)現(xiàn)RUNX2與MTA1共同的結合位點有10455個，且兩者具有相同的結合序列。

單鏈基因組DNA可以折疊成G-四鏈體（G4）結構或形成DNA:RNA雜交（R環(huán)）。最近的研究表明，這種非標準的DNA結構影響基因表達、DNA甲基化、復制叉進展和基因組穩(wěn)定性。這種結構的功能也可以用CUT&Tag技術進行研究。

從以上研究案例可知，CUT&Tag技術可以識別全基因組中目標蛋白占據(jù)的位置的序列信息，這種目標蛋白包含各類組蛋白和轉錄因子，同時還可以研究染色質本身的特殊結構（G4）。所要求的條件需要有相對應的抗體。

CUT&Tag文庫質檢要求

CUT&Tag文庫的特征與常見的轉錄組或基因組文庫不同，它通常與所研究的蛋白有關，文庫峰圖通常無統(tǒng)一標準。如圖所示。

圖2 | 組蛋白H3K27me3的CUT&Tag峰圖

圖3 | 一種轉錄因子的CUT&Tag質檢圖

圖4 | 組蛋白H3K4me3的CUT&Tag質檢圖

CUT&Tag樣本要求

1、樣本類型：細胞系、組織

2、送樣要求：

（1）細胞系：細胞數(shù)10-10個左右（細胞數(shù)越多結果越好），凍存送樣，凍存前細胞活率需>90%，注明樣本種屬，細胞系種類，無支原體污染；

說明：雖然該方法最低可使用100個左右細胞開展實驗，但是如果客戶提供細胞數(shù)量太少，無法對細胞進行質檢，后續(xù)的實驗效果無法保證，所以建議送樣細胞數(shù)在10個以上，如果您要研究的是轉錄因子，細胞數(shù)最好達到5×10個以上。

（2）組織樣本：

1. 如果需要做單細胞解離，對于動物組織，需要用組織保存液保存樣本，并提前與內部實驗人員溝通好實驗時間，便于及時開展實驗。組織量一般在500mg左右。植物組織樣本如需制備原生質體，需要寄送活體植物。

2. 如果是制備細胞核開展項目，則無論動物還是植物組織，只需要液氮速凍，干冰寄送就可以了。需提供500mg左右組織。

   
   

3、抗體：

CUT&Tag需要一抗和二抗，歐易生物提供二抗。

1. 一抗需要客戶提前進行抗體特異性驗證（WB條帶單一，大小符合預期，無明顯雜帶，提供的WB圖為全圖，不要截圖，便于實驗人員判斷抗體的特異性）。

2. 客戶需要提供一抗的詳細信息：供貨商，貨號及抗體說明書或鏈接。

3. 一抗不得稀釋，不得反復凍融，可以分裝（體積不能少于10μl），建議原管寄送。公司會保存剩余抗體，實驗完成后可返還抗體。

4. 寄送時要注意抗體的保存溫度。客戶需填寫清楚靶蛋白的信息。

   
   

CUT&Tag項目的相關問題

1.CUT&Tag適用于什么物種?

CUT&Tag 技術廣泛適用于常規(guī)哺乳動物細胞的蛋白質-DNA互作研究，酵母、植物等細胞可以經過特殊的處理(破除細胞壁或者提取細胞核)來進行實驗。

2.需要做IgG的陰性對照嗎？

在CUT&Tag實驗中包括IgG對照的目的是確定pA-Tn5是否特異性的定位于抗體所在/富集的基因組區(qū)域。與ChIP-Seq中使用的input對照不同，此陰性對照不用于分析。添加IgG對照不會增加任何有價值的信息，因為pA-Tn5已經被證明是特異的。但是，如果需要添加IgG作為對照，也是可以的。

3.CUT&Tag是否需要像ChIP-Seq一樣的Input對照？

不需要。

4. 是否可以返還CUT&Tag實驗回收的樣本用于qPCR檢測？

CUT&Tag實驗回收的樣本不能用于qPCR檢測。

5.CUT&Tag是否可以用于標簽蛋白？

可以。

6.CUT&Tag文庫的質控標準是什么？

CUT&Tag文庫生成后，應通過TapeStation 或 Bioanalyzer來評估文庫的質量，Qubit測定文庫的濃度，文庫的常見圖譜可見圖2和圖3。

7.細菌樣本是否可以做CUT&Tag實驗？

Con A beads通過結合糖蛋白與細胞膜結合，細菌有一層細胞壁，不能直接與Con A beads結合。且細菌沒有完整的核結構，因此無法開展此項實驗。

附錄：細胞系凍存（只針對細胞系懸液）：

1. 從培養(yǎng)箱中取出細胞，顯微鏡下觀察，確定生長狀態(tài)良好且無污染；

2. 取合適時期的細胞培養(yǎng)液，每管分裝細胞數(shù)量10~10個， 各準備 2 管（生物學重復樣本另算），300 g 離心 5 min，吸棄培養(yǎng)液，用 1 mL 室溫 1 x PBS清洗細胞 2~3 次，離心后吸棄上清 PBS；

3. 加入 1mL預冷的細胞凍存液，輕輕吹打細胞沉淀混勻， 慢速降溫凍存。梯度降溫：4℃ 10 min→ -20℃ 30 min→ -80℃ 16～18 h（過夜）→液氮；或者程序降溫：使用等速降溫機以-1～-3℃/min 由室溫降至-80℃~-120℃，→液氮。

注：

1、凍存細胞是90%培養(yǎng)基+10%DMSO中放置在-80℃里保存的。不要用液氮快速冷凍你的樣品，因為會使你的細胞裂解、染色質外漏，會導致你的背景信號非常高。在進行CUT&Tag步驟之前，37℃快速解凍細胞。

2、對于貼壁細胞來說，關鍵是不要用胰蛋白酶分離細胞，因為它會破壞細胞與刀豆球蛋白A結合的表位。使用無酶分離法收集細胞，如使用細胞刮刀。

歡迎百度搜索歐易生物——訪問歐易生物官網——了解CUT&Tag技術

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