前

言

香港中文大學醫(yī)學院于君教授課題組在Gut期刊發(fā)表的題為 “Dietary cholesterol drives fatty liver-associated liver cancer by modulating gut microbiota and metabolites ”的研究成果，通過糞便微生物16S rRNA測序和血清LC-MS代謝組研究方法，發(fā)現(xiàn)了膽固醇調(diào)節(jié)的微生物群在 NAFLD-HCC 中的直接作用，并發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀恢復(fù)了膽固醇誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)并完全阻止了 NAFLD-HCC 的發(fā)展。確認了膳食膽固醇通過誘導(dǎo)小鼠腸道微生物群和代謝物的改變來驅(qū)動 NAFLD-HCC 的形成。膽固醇抑制治療和腸道菌群操作可能是預(yù)防 NAFLD-HCC 的有效策略，為治療NAFLD-HCC提供了理論依據(jù)。

中文標題：膳食膽固醇通過調(diào)節(jié)腸道微生物群和代謝物來驅(qū)動脂肪肝相關(guān)的肝癌

研究對象：小鼠

發(fā)表期刊：Gut

影響因子：23.059

發(fā)表時間：2020 年7月

研究單位：香港新界香港中文大學消化疾病研究所及內(nèi)科及藥物治療學系

運用生物技術(shù)：血清代謝組分析、微生物16S rRNA測序

研究背景

非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，包括從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 的一系列肝臟病變。NASH 可進展為肝硬化、終末期肝功能衰竭和肝細胞癌 (HCC)。在肝臟脂質(zhì)種類中，膽固醇被認為是 NASH 發(fā)展中的主要脂毒性分子。肝臟是調(diào)節(jié)全身膽固醇穩(wěn)態(tài)的中心。在 NASH 的人類和實驗?zāi)Ｐ椭卸甲C實了肝臟膽固醇穩(wěn)態(tài)的異常。我們發(fā)現(xiàn)角鯊烯環(huán)氧酶是膽固醇生物合成中的一種限速酶，可促進 NAFLD-HCC 的發(fā)展。膳食膽固醇對血漿和肝臟膽固醇穩(wěn)態(tài)具有重要影響。長期膽固醇治療對自發(fā)性和進行性 NAFLD-HCC 發(fā)展的作用和發(fā)病機制尚不清楚。

腸道微生物群與其宿主具有共生關(guān)系，并通過在大腸中代謝包括膽固醇在內(nèi)的膳食成分來提供營養(yǎng)和能量。研究表明，腸道微生物組是導(dǎo)致 NAFLD 發(fā)展及其進展為 NAFLD-HCC 的環(huán)境因素。然而，腸道菌群失調(diào)是否是膳食膽固醇誘導(dǎo)的 NASH 和 NAFLD-HCC 進展的原因或影響仍不清楚。

本研究確定膳食膽固醇在 NAFLD-HCC 發(fā)展中的作用和相關(guān)分子機制。我們發(fā)現(xiàn)膳食膽固醇通過膽固醇誘導(dǎo)的腸道微生物群變化和代謝組學改變導(dǎo)致自發(fā)的 NAFLD-HCC 形成。膽固醇抑制恢復(fù)了腸道微生物群并完全阻止了 NAFLD-HCC 的發(fā)展。

研究思路

研究結(jié)果

膳食膽固醇自發(fā)驅(qū)動 NAFLD-HCC 的發(fā)展

為了檢查膳食膽固醇在脂肪變性、NASH、纖維化和NAFLD-HCC 演變中的作用，給小鼠喂食 HFHC、HFLC 或 NC。在不同時間點（3、8、10、12 和 14 個月）監(jiān)測血清甲胎蛋白（AFP，肝癌標志物）水平。與喂食 HFHC 的小鼠相比，在第 10 個月觀察到 AFP 水平升高（107.1±127.9 ng/mL），在第 12 個月（151.6±129.3 ng/mL）和第 14 個月（174.2±203.1 ng/mL）進一步升高在第 14 個月使用 HFLC（HFLC 中為 50.9±7.5 ng/mL）或 NC（59.7±20.9 ng/mL）（圖 1A）。MRI 掃描顯示 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠在第 14 個月時出現(xiàn)肝腫瘤，但在 HFLC 喂養(yǎng)或 NC 喂養(yǎng)的小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)（圖 1B ）。然后在第 14 個月收獲小鼠。在 68% (13/19) 喂食 HFHC 的小鼠中發(fā)現(xiàn)肝腫瘤，但在喂食 HFLC 或 NC 飲食的小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)肝腫瘤（圖 1C）。肝臟切片的組織學檢查證實所有肝臟腫瘤均為 HCC（圖 1C），每只小鼠平均有 2.7±2.6 個 HCC，最大腫瘤直徑為 4.1±5.0 mm。與 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠相比，HFHC 喂養(yǎng)小鼠的肝臟切片中 Ki-67 陽性細胞明顯增多，表明 HFHC 喂養(yǎng)小鼠的細胞增殖增加（圖 1C）。這些結(jié)果表明，膳食膽固醇可以自發(fā)誘導(dǎo) NAFLD-HCC 的形成。

隨著 HCC 的形成，與 NC 喂養(yǎng)的小鼠相比，HFHC 喂養(yǎng)的小鼠在第 14 個月時體重、內(nèi)臟脂肪、肝臟重量和肝體重比顯著增加（圖 1D）。喂食 HFLC 的小鼠體重、內(nèi)臟脂肪和肝臟重量也有所增加（圖 1D）。與 HFLC 喂養(yǎng)或 NC 喂養(yǎng)的小鼠相比，HFHC 喂養(yǎng)的小鼠的血清膽固醇、肝臟游離膽固醇和膽固醇酯、葡萄糖耐受不良和空腹胰島素顯著增加（圖 1E）。與 NC 相比，在喂食 HFLC 的小鼠中也觀察到增強的葡萄糖耐受不良和空腹胰島素（圖 1E）。

圖1 | 膽固醇在 C57BL/6 小鼠中誘導(dǎo)自發(fā) HCC 形成

a)喂食 HFHC 飲食 3、8、10、12 和 14 個月的小鼠以及喂食 NC 或 HFLC 飲食 14 個月的小鼠的血清 AFP 水平；

b)肝臟 MRI,

c)喂食 NC、HFLC 和 HFHC 14 個月的小鼠肝臟中 Ki67 染色的代表性大體形態(tài)、代表性顯微特征和免疫組織化學圖片, Ki-67 根據(jù)以下標準評分: 0 ( <10 %細胞染色）、1（11 % –30% 細胞染色）、2（30 % –50% 細胞染色）或 3（>50 %細胞染色）

d)喂食 NC、HFLC 的小鼠的體重、內(nèi)臟脂肪、肝臟重量、肝臟重量比、

e)血清膽固醇水平、肝臟游離膽固醇、肝臟膽固醇酯含量、葡萄糖耐量試驗和空腹胰島素水平和 HFHC 14 個月。

喂食高膽固醇飲食 14 個月的小鼠出現(xiàn) NASH 和纖維化

肝臟切片的進一步檢查顯示，在 HFHC 喂養(yǎng) 14 個月的小鼠的 HCC 鄰近肝組織和非 HCC 肝組織中存在以脂肪變性和小葉炎癥為特征的脂肪性肝炎，而在 HFLC 喂養(yǎng)的小鼠中僅觀察到脂肪變性（圖 2A）。與組織學炎癥一致，與喂食 HFLC 或 NC 的小鼠相比，喂食 HFHC 的小鼠的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT) (p<0.01) 和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST) (p<0.01) 水平顯著增加（圖 2B）。血清和肝臟促炎細胞因子包括 IL-6、IL-1α 和 IL-1β（圖 2C、D）在 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠中增加。RNA測序表明，與HFLC喂養(yǎng)的小鼠相比，14個月HFHC喂養(yǎng)小鼠的肝組織中關(guān)鍵的NASH相關(guān)促炎細胞因子，包括Cx3cl1、Mcp1、Cxcl10、Mip1β、Mip1α、Ccl5、Cxcl16和Tnfα，顯著上調(diào)（圖 2D）。

HFHC 喂養(yǎng)的小鼠表現(xiàn)出嚴重的纖維化損傷，膠原分布區(qū)域顯著增加（圖 2E），通過肝羥脯氨酸測定法測定的膠原含量（圖 2F）和肝星狀細胞活化，如增加的 α-平滑肌肌動蛋白 (α-SMA) mRNA 和蛋白質(zhì)水平（圖 2E）。對肝臟氧化應(yīng)激的檢查顯示，在 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠中，氧化的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 與 NADH（NAD 的還原形式）的比率和抗氧化超氧化物歧化酶 (SOD) 活性顯著降低（圖 2G），表明肝臟氧化飲食膽固醇的壓力?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明 NASH 和纖維化是在 HFHC 喂養(yǎng)小鼠的非 HCC 肝組織中形成的。

圖2 | 膽固醇在喂食 HFHC 飲食的小鼠的非 HCC 肝組織中引起 NASH 和纖維化。

a)具有代表性的 H&E 染色、肝切片的組織學評分；

b)血清 ALT 和 AST 水平；

c)用 NC、HFLC 和 HFHC 喂養(yǎng) 14 個月的小鼠通過細胞因子分析測定的血清 IL-6、IL-1α 和 IL-1β 蛋白水平；

d)用 HFLC 和 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠的 RNA 測序通過 ELISA 和 Cx3cl1、Mcp1、Cxcl10、Mip1β、Mip1α、Ccl5、Cxcl16、Tnfα mRNA 水平測定肝臟促炎細胞因子 IL-6、IL-1α 和 IL-1β 蛋白水平14個月；

e)天狼星紅染色的膠原沉積，免疫組織化學染色和 RT-PCR 的 α-SMA 蛋白和 mRNA 水平

f)肝臟羥脯氨酸含量

g)用 NC、HFLC 和 HFHC 喂養(yǎng) 14 個月的小鼠的肝臟 NAD+ 與 NADH 比率和 SOD 活性。

高膽固醇飲食在小鼠中依次導(dǎo)致脂肪肝、脂肪性肝炎和纖維化

為了闡明飲食膽固醇在 HCC 形成之前 NAFLD 的進展，我們監(jiān)測了喂食 HFHC 的小鼠的血清 ALT、AST、膽固醇、AFP 和肝臟組織學變化。在飲食喂養(yǎng)后 3、8、10 和 12 個月收獲小鼠（圖 3A）。我們觀察到在 3 個月和 8 個月時，與喂食 HFLC 的小鼠相比，喂食 HFHC 的小鼠的體重和內(nèi)臟脂肪重量增加，同時肝臟重量和肝體重比增加。血清 ALT 和 AST 的增加與 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠血清膽固醇水平升高一致。HFHC 喂養(yǎng)小鼠的肝臟組織學顯示，3 個月時有輕度炎癥的脂肪變性，8 個月時伴有纖維化的脂肪性肝炎，10、12 和 14 個月時有 HCC 形成，而 HFLC 喂養(yǎng)的小鼠在 3、8 個月時僅顯示脂肪變性而沒有進一步的 HCC 發(fā)展。10 個月和 14 個月（圖 3B）。我們還對兩種 HCC 標志物 AFP 和高爾基蛋白 73 (GP73) 進行了免疫組化。

在 HFHC 喂養(yǎng)小鼠的肝組織上觀察到陽性染色，但在 HFLC 喂養(yǎng)的小鼠身上沒有觀察到陽性染色。肝臟脂肪變性、小葉炎癥和肝膠原區(qū)域的評分證實了整個疾病階段肝臟組織學的嚴重程度增加（圖 3B）。此外，10% (1/10) 的 HFHC 喂養(yǎng)小鼠在 10 個月時發(fā)展為 HCC（腫瘤數(shù) = 0.1 ± 0.32，最大腫瘤直徑 = 0.55 ± 1.74 mm），25% (3/12) 在 12 個月時發(fā)展為 HCC（腫瘤數(shù)=0.25 ± 0.45，最大腫瘤直徑=1.57 ± 3.10 mm) 和 68% (13/19) 在 14 個月時發(fā)展為 HCC（圖 3C），表明 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠逐漸發(fā)展為脂肪變性、脂肪性肝炎、纖維化和 NAFLD–肝癌。

圖3 | 喂食 HFHC 的小鼠依次發(fā)展為脂肪肝、脂肪性肝炎、纖維化和 HCC

a)用 HFHC 飲食治療 C57BL/6 小鼠的示意圖。在 3、8、10 和 12 個月大時處死小鼠。

b)喂食 HFLC 14 個月和喂食 HFHC 3、8、10、12 和 14 個月的小鼠肝臟中腫瘤標志物 AFP 和 GP73 的代表性大體形態(tài)、H&E 染色和 IHC 染色；計算脂肪變性和炎癥的組織學評分以及天狼星紅染色的定量。

c)不同時間點喂食 HFHC 的小鼠的最大腫瘤的腫瘤發(fā)病率、腫瘤數(shù)量和最大腫瘤直徑。

在 NAFLD-HCC 的發(fā)生和發(fā)展過程中，膳食膽固醇誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)

為了探索腸道微生物群在介導(dǎo)膳食膽固醇誘導(dǎo)的 NAFLD-HCC 中的潛在作用，我們對 14 個月時喂食 HFLC 和喂食 HFHC 的小鼠的糞便進行了 16S rRNA 基因測序。分析表明，觀察到的操作分類單元 (OTU) 數(shù)量達到飽和。通過主成分分析 (PCA) 在 14 個月時，在喂食 HFLC 和喂食 HFHC 的小鼠之間觀察到腸道微生物群組成分離 (p<0.001) (圖 4A )。此外，與 HFLC 飲食喂養(yǎng)的小鼠相比，在 14 個月時，在 HFHC 喂養(yǎng)的 HCC 小鼠中觀察到較低的細菌多樣性和增加的細菌豐富度（圖 4A ）。通過差異豐度分析確定膽固醇相關(guān)的細菌類群。與喂食 HFLC 的小鼠相比，喂食 HFHC 的小鼠中幾種細菌 OTU 的豐度存在差異（圖 4B）。主成分和冗余分析還顯示，喂食 HFHC 3 個月（伴有輕度炎癥的簡單脂肪變性）、8 個月（伴有纖維化的脂肪性肝炎）和 14 個月（HCC）的小鼠的微生物群組成明顯聚集（圖 4C），表明在NAFLD-HCC 進展階段的腸道微生物群。此外，隨著 NAFLD-HCC 的進展，細菌豐富度依次增加（圖 4D）。特別是，觀察到Mucispirillum schaedleri_Otu038、Desulfovibrio_Otu047、Anaerotruncus_Otu107和Desulfovibrionaceae_Otu073從 3 個月到 8 個月和 14 個月的 HFHC 喂養(yǎng)依次增加（圖 4D）。此外，除其他外，我們觀察到的富集梭菌個OTU如梭菌celatum_Otu070，C. ruminantium_Otu059，C. cocelatum_Otu036和C. methylpentosum_Otu053，以及耗盡Bifidobacterium_Otu026，Akkermansia municiphila_Otu034，Lactobacillus_Otu009，擬桿菌acidifaciens_Otu032，Bacteroides_Otu012，B. uniformis_Otu080和乙.egerthii_Otu079與高膳食膽固醇。此外，與 HFHC 喂養(yǎng)的無腫瘤小鼠相比，富含 HFHC 的甘曼尼螺桿菌_Otu031在有腫瘤的 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠中更豐富，而在有腫瘤的 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠中，與沒有腫瘤的 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠相比，HFHC 耗盡的擬桿菌屬_Otu012 減少。這些表明，甘曼螺桿菌_Otu031的進一步富集和擬桿菌屬_Otu012的消耗可能對腸道菌群在NAFLD-HCC中的作用很重要。此外，與 HFLC 喂養(yǎng)的小鼠相比，HFHC 喂養(yǎng)的小鼠腸道微生物群相關(guān)的色氨酸代謝能力降低（圖 4）。這些綜合起來表明，高膽固醇飲食會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)和微生物色氨酸代謝受損。

對細菌豐度與小鼠表型的潛在關(guān)聯(lián)相關(guān)性分析。我們觀察到M. schaedleri_Otu03 8, Desulfovibrio_Otu047, Anaerotruncus_Otu107, C. celatum_Otu070 , C. cocelatum_Otu036和C.methylpentosum_Otu053在 HFHC 喂養(yǎng)小鼠的糞便樣本中富集呈正相關(guān)（圖4F），而Bifidobacterium_Otu026, B. acidifac 、A. municiphila_Otu034和Lactobacillus_Otu009在 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠中被耗盡，與高膽固醇飲食、血清和肝臟膽固醇水平呈負相關(guān)（圖 4F）。這些結(jié)果表明 NAFLD-HCC 中的腸道菌群失調(diào)與膽固醇水平相關(guān)。

為了證實我們在人類患者動物實驗中的發(fā)現(xiàn)，我們分析了 59 例高膽固醇血癥患者和 39 名健康受試者的血清膽固醇和腸道微生物群的相關(guān)性。雙歧桿菌和擬桿菌與血清總膽固醇和低密度脂蛋白 (LDL)-膽固醇呈負相關(guān)，但與高密度脂蛋白 (HDL)-膽固醇呈正相關(guān)（圖 4G）。這些結(jié)果與喂食 HFHC 的小鼠的觀察結(jié)果一致，進一步推斷腸道微生物群參與了膽固醇誘導(dǎo)的疾病。

圖4 | 膳食膽固醇誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)。

a)14 個月 HFLC 和 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠之間的主成分排序分析 (PcoA)、香農(nóng)多樣性和腸道微生物群的豐富度。

b)喂食 HFLC 或 HFHC 14 個月的小鼠糞便中細菌的熱圖。

c)分別喂食 3 個月、8 個月和 14 個月的 HFHC 后腸道菌群的 PCoA 和冗余分析。

d)通過 chao1 指數(shù)測量的微生物群豐富度，并在 HFHC 喂養(yǎng)的 3、8 至 14 個月內(nèi)依次增加細菌。

e)HFLC 喂養(yǎng)和 HFHC 喂養(yǎng)小鼠的腸道微生物群色氨酸代謝能力。

f)細菌豐度與小鼠表型的相關(guān)性。

g)宏基因組測序與血清總膽固醇、甘油三酯、59 例高膽固醇血癥人類病例和 39 名健康受試者中的 LDL-膽固醇和 HDL 膽固醇。

膳食膽固醇通過誘導(dǎo)代謝物改變促進 NASH-HCC 進展

為了揭示可能與膽固醇誘導(dǎo)的 NAFLD-HCC 相關(guān)的與腸道微生物組相關(guān)的代謝表型，我們對喂食 HFHC 和喂食 HFLC 的小鼠的血清進行了代謝組學分析。根據(jù) PCA 測定的膳食膽固醇含量，血清代謝物存在顯著差異（圖 5A）。膽汁酸生物合成是喂食高膽固醇飲食的小鼠中改變的關(guān)鍵途徑（圖 5B）。在 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠中，包括?；悄懰?(TCA)、?；切苋パ跄懰?(TUDCA)、甘氨膽酸 (GCA) 和?；蛆Z去氧膽酸 (TCDCA) 在內(nèi)的初級膽汁酸是異常上調(diào)的代謝物（圖 5C）。另一方面，作為微生物色氨酸代謝產(chǎn)物的 3-吲哚丙酸 (IPA)在 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠中是異常下調(diào)的代謝物（圖 5C）。此外，與 HFLC 喂養(yǎng)的小鼠相比，HFHC 喂養(yǎng)的小鼠門靜脈中血清脂多糖 (LPS) 濃度升高，結(jié)腸 E-鈣粘蛋白丟失（圖 5D），這表明膳食膽固醇會損害腸道屏障功能。進行相關(guān)性分析以確定 HFHC 改變的微生物和代謝物的潛在關(guān)聯(lián)。一致地，相關(guān)性分析表明，富含 HFHC 的Mucispirillum schaedleri_Otu038與 TUDCA、TCDCA、TCA 和 GCA 呈正相關(guān)。富含 HFHCRoseburia_Otu056和Helicobacter_ganmanii_Otu031也與 TUDCA 和 TCDCA 呈正相關(guān)。此外，HFHC 耗盡的Akkermancia_muciniphila_Otu034與 TCDCA 和 TUDCA 呈負相關(guān)，而 HFHC 富集的Anaerotruncus_Otu107與 IPA 呈負相關(guān)（圖 5E）。

進一步的實驗表明，高膳食膽固醇不能改變膽汁酸合成酶的 mRNA 表達，包括肝臟中的細胞色素 P450 (Cyp)7a1、Cyp8b1、Cyp27a1 和 Cyp7b1（圖 5F）。額外的體外實驗表明，TCA 在人類正常永生化肝細胞系 LO2 中加重了膽固醇誘導(dǎo)的甘油三酯積累（圖 5G），而 IPA 抑制了 NASH 中膽固醇誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累（圖 5G）和細胞增殖（圖 5H）– HCC細胞系，HKCI-2和HKCI-10。這些結(jié)果表明，膽固醇通過調(diào)節(jié)宿主血清代謝物以及至少部分通過增加 TCA 和減少 IPA 來促進 NASH-HCC 進展。

圖5 | 膳食膽固醇誘導(dǎo)的小鼠血清代謝譜的改變。

a)通過主成分排序分析，喂食 HFLC 和 HFHC 飲食的小鼠的血清代謝物顯著不同。

b)喂食 HFHC 飲食的小鼠中差異富集的代謝物的途徑分析。

c)喂食 HFLC 和 HFHC 飲食的小鼠血清代謝組學火山圖，顯示了代謝物的異常值。

d)喂食 HFLC 和 HFHC 飲食 3 個月的小鼠門靜脈血液中的 LPS 濃度和喂食 14 個月 HFLC 和 HFHC 飲食的小鼠結(jié)腸組織中 E-鈣粘蛋白的表達。

e)HFHC 改變的微生物和代謝物關(guān)聯(lián)的相關(guān)性分析。

f)喂食 HFLC 和 HFHC 飲食的小鼠肝組織中 Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1 和 Cyp7b1 的 mRNA 水平。

g)通過油紅 O 染色，TCA 加重了膽固醇誘導(dǎo)的人 LO2 細胞系中的甘油三酯積累，而 IPA 抑制了 NASH-HCC 細胞系、HKCI-2 和 HKCI-10 中膽固醇誘導(dǎo)的甘油三酯積累。膽固醇，200 μg/mL；

h)IPA 抑制 NASH-HCC 細胞系中的細胞增殖。

高膽固醇調(diào)節(jié)的腸道微生物群促進無菌小鼠的脂肪性肝炎和肝細胞增殖

我們通過糞便微生物群移植（FMT）評估了膽固醇調(diào)節(jié)的微生物群在 NAFLD-HCC 中的貢獻。在 NC 飲食下，將 NC 喂養(yǎng)、HFLC 喂養(yǎng)和 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠（14 個月）的糞便灌胃給無菌小鼠（G-NC、G-HFLC 和 G-HFHC）（圖 6A）。與 G-NC 小鼠相比，G-HFHC 小鼠的肝體重比顯著更高。此外，甘油三酯測定和油紅O染色（圖6B）的肝臟脂質(zhì)積累和硫代***酸反應(yīng)物質(zhì)測定（圖6B）的過氧化顯著增加，同時H＆E染色的肝臟組織學受損（圖6B ）在 FMT 后 8、10 和 14 個月的 G-HFHC 小鼠中。通過細胞因子分析測定增強的肝細胞因子和趨化因子包括 IL-6（圖 6C ），通過 cDNA 表達測定，F(xiàn)os、Ccl12、Cxcr1、Ccl1、Myd88、Il-1β、Cxcl10 和 C3ar1。證明炎癥增加與 G-HFLC 小鼠相比，通過流式細胞術(shù)在 G-HFHC 小鼠中增強 CD45+ 淋巴細胞積累。

在 14 個月時，在 G-HFHC 小鼠的肝臟中觀察到肝細胞增殖增加（p<0.05）（圖 6D），但在 FMT 后 8 個月和 10 個月則沒有。癌癥通路 PCR 陣列顯示肝組織中涉及致癌通路的基因上調(diào)，包括細胞增殖 (Cdc20)、血管生成 (Pgf)、侵襲/轉(zhuǎn)移 (Serpinb2、Snai3) 和參與細胞凋亡的基因 (Fasl 和 Lpl) 下調(diào)-HFHC 小鼠與 G-NC 和 G-HFLC 小鼠相比（圖 6E1）。通過蛋白質(zhì)印跡驗證CDC20的上調(diào)（圖6E2）。G-HFHC 小鼠在 14 個月時觀察到一個肝結(jié)節(jié)，但在 8 和 10 個月時未觀察到（圖 6A）。組織學檢查證實結(jié)節(jié)為具有小球和細胞增殖增加的不典型增生（圖 6A）。我們評估了受體無菌小鼠及其相應(yīng)的供體常規(guī)小鼠腸道微生物群的組成。我們發(fā)現(xiàn)，與供體飲食相關(guān)的受體無菌小鼠的腸道微生物群存在顯著差異（圖 6F）。如 β 多樣性和組成分析所示，F(xiàn)MT 后的微生物生態(tài)系統(tǒng)在所有小鼠組中隨時間保持穩(wěn)定。此外，無菌小鼠血清代謝物分析顯示，與喂食 HFHC 的常規(guī)小鼠相比，G-HFHC 小鼠的 IPA 降低（圖 6G）?？傊@些數(shù)據(jù)表明膳食膽固醇調(diào)節(jié)的微生物群通過誘導(dǎo)代謝物改變來促進 NAFLD 和肝細胞增殖，從而促進膽固醇誘導(dǎo)的 NAFLD-HCC 形成。

圖6 | 高膽固醇調(diào)節(jié)的微生物群促進無菌小鼠模型中的肝細胞增殖

a)糞便從 NC 喂養(yǎng)、HFLC 喂養(yǎng)和 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠（14 個月）移植到 NC 下的無菌小鼠（G-NC、G-HFLC 和 G-HFHC）。顯示了 G-NC、G-HFLC 或 GHFHC 組灌胃無菌小鼠肝臟的大體形態(tài)、組織學檢查和 Ki-67 染色。

b)G-NC、G-HFLC 或 G-HFHC 組的受體無菌小鼠在 8、10 和 14 個月時的肝臟甘油三酯含量、脂質(zhì)過氧化和肝臟組織學。

c)G-NC、G-HFLC 或 G-HFHC 組在 14 個月時的肝臟 IL-6 蛋白水平和

d)Ki-67 染色。(E1) G-NC、G-HFLC 或 G-HFHC 小鼠肝組織中的小鼠癌癥通路 Finder PCR 陣列。

e)CDC20 蛋白水平得到驗證。

f)G-NC、G-HFLC 或 G-HFHC 小鼠腸道菌群線性判別分析 (LDA) 得分的主成分排序分析和直方圖。

g)G-HFLC 和 G-HFHC 小鼠的血清代謝組學分析。

抗膽固醇治療完全防止HFHC喂養(yǎng)小鼠的NAFLD-HCC形成

由于膳食膽固醇驅(qū)動 NAFLD-HCC 的進展，我們評估了抗膽固醇藥物是否可以抑制 NAFLD 及其進展為 HCC。阿托伐他汀 (20 mg/kg) 是一種降膽固醇藥物，對已喂食 HFHC 7 個月的小鼠給藥，并繼續(xù)喂食 HFHC 和阿托伐他汀 7 個月（圖 7A）。在實驗結(jié)束時（14 個月），阿托伐他汀完全阻止了 HFHC 飲食誘導(dǎo)的 NAFLD-HCC 形成，并改善了 NASH 的嚴重程度（圖 7B）。這伴隨著血清膽固醇、肝游離膽固醇、血清 AFP 顯著降低（圖 7C）、ALT、降低血清促炎細胞因子（IL-6、IL-1α、IL-1β、MCP-1、MIP-1α 和 MIP-1β）和氧化應(yīng)激（增加 NAD+ 與 NADH 的比率和 SOD 活性）（圖7D )。阿托伐他汀還通過顯著減少肝膠原沉積和羥脯氨酸含量來改善肝纖維化（圖 7E）。通過 16S rRNA 基因測序對在阿托伐他汀治療 (HFHC+At) 下喂食 HFHC 的小鼠的糞便進行微生物群分析，并與喂食 NC、HFLC 和 HFHC 的小鼠進行比較?？鼓懝檀及⑼蟹ニ≈委燂@著恢復(fù)了喂食 HFHC 的小鼠的細菌豐富度（圖 7F）。

此外，在 HFHC 喂養(yǎng)小鼠的失調(diào) OTU 中（圖 4B 和 D)，發(fā)現(xiàn)Mucispirillum schaedleri_Otu038、Desulfovibrio_Otu047、Anaerotruncus_Otu107和Desulfovibrionaceae_Otu073的豐度被抗膽固醇處理逆轉(zhuǎn)（圖 7F）。為了研究微生物群在抗膽固醇藥物預(yù)防的 NAFLD-HCC 中的直接作用，我們將 HFHC+At 小鼠的糞便灌胃給無菌小鼠（G-HFHCat，n=10）。與 G-HFHC 組相比，G-HFHCat 小鼠在灌胃后 14 個月表現(xiàn)出肝臟組織學改善，肝臟甘油三酯和脂質(zhì)過氧化降低（圖 7G）。在用阿托伐他汀治療的 HFHC 小鼠中觀察到 IPA 的誘導(dǎo)和 TCA 的減少。這些結(jié)果進一步表明，腸道微生物群在介導(dǎo)膽固醇誘導(dǎo)的 NAFLD-HCC 中發(fā)揮著積極作用。

圖7?| 膽固醇抑制消除了 HFHC 喂養(yǎng)小鼠的 NAFLD-HCC 進展

a)喂食 HFHC 飲食的 C57BL/6 小鼠的阿托伐他汀治療示意圖。

b)用或不用阿托伐他汀治療的 H&E 染色 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠肝臟的代表性總體形態(tài)和顯微特征，計算脂肪變性、炎癥和膠原蛋白的組織學評分。

c)血清膽固醇水平、肝臟游離膽固醇水平、血清 AFP 水平

d)血清 ALT 水平、肝臟 NAD+ 與 NADH 比率、肝臟 SOD 活性、血清 IL-6、IL-1α、IL-1β、MCP-1、在接受或不接受阿托伐他汀治療的 HFHC 喂養(yǎng)小鼠中，MIP-1α、MCP-1β 蛋白水平、

e)膠原沉積和羥脯氨酸含量。

f)用或不用阿托伐他汀治療的 NC、HFLC 和 HFHC 喂養(yǎng)的小鼠糞便中細菌的細菌豐富度和熱圖圖。

g)HFHCat 糞便灌胃無菌小鼠 (G-HFHCat) 中肝臟的大體形態(tài)、組織學檢查、甘油三酯和脂質(zhì)過氧化

h)膽固醇誘導(dǎo)的 NAFLD-HCC 發(fā)展機制示意圖

研究討論

盡管膽固醇在 NASH 中是一種已知的細胞毒性脂質(zhì)，關(guān)于膽固醇在 NASH 引起的 HCC 發(fā)展中的作用和重要機制的信息是有限的。在這項研究中，我們首次證明長期高膳食膽固醇喂養(yǎng)會導(dǎo)致小鼠自發(fā)性 NAFLD-HCC 發(fā)展。我們研究了高膳食膽固醇從 NAFLD 發(fā)展為 HCC 的主要機制。我們發(fā)現(xiàn)喂食高膽固醇飲食的小鼠在 NAFLD-HCC 中 ROS 積累增加。積累的 ROS 是一種有毒介質(zhì)，可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗和氧化損傷。事實上，我們的分析表明，膳食膽固醇會誘導(dǎo) ROS 和促炎細胞因子，從而促進 NASH 和 HCC 的發(fā)展。我們的研究結(jié)果為腸道菌群失調(diào)在膽固醇誘導(dǎo)的 NAFLD-HCC 進展中的潛在作用提供了新的見解。除了腸道菌群失調(diào)外，共生細菌產(chǎn)生的小分子代謝物也可能導(dǎo)致 NAFLD 的發(fā)病。我們的研究結(jié)果表明，膽固醇可能會損害膽汁酸代謝和微生物色氨酸代謝，導(dǎo)致血清 TCA 升高，IPA 降低，從而促進 NAFLD-HCC 的發(fā)展。阿托伐他汀治療的 HFHC 喂養(yǎng)小鼠的糞便不會促進受體無菌小鼠的肝細胞增殖。這些觀察結(jié)果進一步強調(diào)了阿托伐他汀在預(yù)防膽固醇誘導(dǎo)的 NAFLD-HCC 發(fā)展中的潛在用途。

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這項研究首次表明，長期高膳食膽固醇通過調(diào)節(jié)腸道微生物群誘導(dǎo)雄性小鼠自發(fā)和進行性發(fā)展為 NAFLD-HCC。膽固醇通過腸道菌群改變誘導(dǎo) TCA 增加和 IPA 減少，從而促進肝臟中的脂質(zhì)積累和細胞增殖，導(dǎo)致 NAFLD-HCC 發(fā)展?？鼓懝檀贾委熗耆松攀衬懝檀颊T導(dǎo)的 NAFLD-HCC 形成。這項研究強調(diào)了膽固醇抑制和對腸道微生物群及其相關(guān)代謝物的控制可能是預(yù)防 NAFLD-HCC 的有效策略。

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