熒光定量（qPCR）原理、實驗流程及結(jié)果分析
- 目的：由少變多
- DNA合成就會產(chǎn)生小溝，這個染料就喜歡在小溝里面閃閃發(fā)光。
- 染料其發(fā)光的數(shù)量和發(fā)光的程度呈正比
- 缺點：這個染料只識別小溝，所以非特異性擴增時，染料也會結(jié)合到小溝；所以總的熒光量不一定時目的基因的精確表達量。需要保證我們的產(chǎn)物是特異性的。?
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- 5R-發(fā)光基團，3Q-催免基團；兩者相互抵制
- PCR過程中DNA聚合酶就發(fā)揮外切酶活性，水解探針，破壞雙方敵對的情況，漏出閃閃的光。
- 探針的退火溫度比引物的退火溫度高5-8℃；引物和探針是通過退火降溫才結(jié)合在模版上的；那么探針需要比引物先結(jié)合到模版上，才能實現(xiàn)后面的水解過程
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> RNA不穩(wěn)定原因
- 單鏈結(jié)構(gòu)
- OH結(jié)構(gòu)
- RNA酶
> Trizol --- 沉淀法
- RNase H 會降解DNA和RNA雜合鏈中的RNA
- 原核生物沒有polyA尾
- 3'端偏好性
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- 基線期：熒光背景階段
- 指數(shù)增長期：方程才適用
- 線性增長期：
- 平臺期：
- 右圖：每個峰代表一個特異性產(chǎn)物
- 右圖是正常現(xiàn)象
- 閾值放在指數(shù)增長期的中間比較合理，不能過低或過高
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- 基線設(shè)置有問題；或模版濃度過高
- 15 調(diào)整為10
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