寫在前面

????????今天推薦的是由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院在2019年6月19日發(fā)表于Autophagy（IF：10.643，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Chuanxin Huang教授，研究表明泛素特異性蛋白酶USP8直接對(duì)SQSTM1/p62進(jìn)行去泛素化，以抑制其自噬活性。

研究背景

????????SQSTM1/p62（sequestosome 1）是一個(gè)關(guān)鍵自噬受體，促進(jìn)泛素化聚集物的形成和降解。SQSTM1可以被泛素化修飾，這種修飾可以調(diào)節(jié)其自噬活性。然而，支持其去泛素化的分子機(jī)制從未被報(bào)導(dǎo)過。

摘要部分

????????作者報(bào)道了USP8（泛素特異性肽酶8）直接與SQSTM1相互作用并使其去泛素化。USP8優(yōu)先去除SQSTM1的賴氨酸11（K11）連接的泛素鏈。此外，USP8主要在SQSTM1的泛素關(guān)聯(lián)（UBA）域的K420處進(jìn)行去泛素化。最后，USP8抑制了有野生型SQSTM1的細(xì)胞中SQSTM1的降解和自噬，用精氨酸取代K420的突變體則沒有該功能。綜上所述，USP8通過在K420處對(duì)SQSTM1進(jìn)行去泛素化，成為自噬的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)器。

研究內(nèi)容

1.USP8與自噬受體SQSTM1相互作用? ? ?

????????USP8/UBPY定位在內(nèi)體區(qū)間，調(diào)節(jié)包括表皮生長因子（EGF）受體在內(nèi)的許多蛋白質(zhì)的內(nèi)體排序。作者首先研究了USP8是否能與SQSTM1相互作用。為此，作者將USP8-HA或空載轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性SQSTM1和USP8。作者發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性SQSTM1只在USP8-HA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中與抗HA抗體共免疫沉淀。此外，內(nèi)源性USP8與抗SQSTM1抗體共同免疫沉淀。從大腸桿菌中純化的His-USP8被純化的GST-SQSTM1蛋白特異性結(jié)合，表明USP8在體外與SQSTM1直接相互作用。

????????另一方面，作者發(fā)現(xiàn)，使用抗Flag抗體，USP8-HA不能被Flag標(biāo)記的SQSTM1截?cái)嗤蛔凅w（失去殘基85-233）免疫沉淀。這個(gè)片段包含鋅指（ZZ）和TRAF6結(jié)合（TB）結(jié)構(gòu)域。最后，免疫熒光顯示，內(nèi)源性USP8與SQSTM1在HeLa細(xì)胞的核周區(qū)域共同定位。

研究結(jié)論：USP8直接與SQSTM1相互作用。

?

2.USP8在體外和體內(nèi)使SQSTM1去泛素化? ? ?

????????考慮到USP8是一種去泛素化酶，作者接下來研究USP8是否在體外直接對(duì)SQSTM1進(jìn)行去泛素化，作者分別用純化Flag標(biāo)記的泛素化的SQSTM1和HA標(biāo)記的USP8或其催化不活躍的突變體（USP8C786A），將兩者孵化指定的時(shí)間，然后用抗His抗體進(jìn)行免疫印跡。USP8明顯降低了SQSTM1泛素化的水平。這種效果需要USP8的DUB活性，因?yàn)閁SP8C786A不能減少SQSTM1的泛素化。表明USP8在體外直接對(duì)SQSTM1進(jìn)行去泛素化。作為陰性對(duì)照，BAP1（BRCA1相關(guān)蛋白1）去泛素化酶未能減少體外產(chǎn)生的SQSTM1泛素化物種的水平，表明USP8在控制SQSTM1泛素化方面的特異性。

????????作者接下來試圖確定USP8是否會(huì)影響體內(nèi)SQSTM1的泛素化。為此，作者將His-SQSTM1和USP8-Flag轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)，野生型USP8，而不是USP8C786A突變體，減少了SQSTM1的泛素種類。作者還觀察到，USP8能夠減少應(yīng)激條件下誘發(fā)的SQSTM1的泛素化。泛素化的SQSTM1與泛素化的蛋白一起，不斷地被招募到成長中的自噬體中進(jìn)行溶酶體的降解。在基礎(chǔ)條件下，泛素化的SQSTM1在細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到。據(jù)報(bào)道，用巴菲霉素A1（BafA1）處理，這是一種通過阻斷自噬體/溶酶體融合的自噬抑制劑，會(huì)導(dǎo)致泛素化的SQSTM1蛋白在細(xì)胞中的積累。作者發(fā)現(xiàn)，在BafA1處理的MEFs中，敲減內(nèi)源性Usp8明顯增強(qiáng)了內(nèi)源性SQSTM1的泛素種類。

研究結(jié)論：USP8是SQSTM1的去泛素酶。

?

3.USP8優(yōu)先去除SQSTM1的k11連接泛素鏈

????????據(jù)報(bào)道，SQSTM1已被K29-、K33-、K48-和K63連接的聚泛素鏈修飾。USP8已被證明可以去除K48-、K63-、K11-和K6-連接的泛素鏈。為此，作者將His- SQSTM1、USP8-Flag和各種HA標(biāo)記的Ub突變體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞。USP8的過量表達(dá)明顯抑制了SQSTM1的野生型和K11連接的泛素化，并在較小的程度上抑制了K48和K63連接的泛素化。使用針對(duì)K63和K48連接的泛素鏈的特異性抗體，作者發(fā)現(xiàn)USP8敲減并沒有增加細(xì)胞中內(nèi)源性SQSTM1的K63和K48連接的聚泛素化，表明內(nèi)源性USP8對(duì)于去除SQSTM1的K48和K63連接的泛素鏈?zhǔn)遣恍枰摹?/span>

研究結(jié)論：USP8優(yōu)先從SQSTM1上清除K11連接的泛素鏈。

?

4.USP8主要在K420處使SQSTM1去泛素化

????????作者接下來確定SQSTM1的哪些賴氨酸殘基可能會(huì)受到USP8的影響。最近報(bào)道，UBA結(jié)構(gòu)域中的殘基K420是SQSTM1的主要泛素化部位。K420的泛素化增強(qiáng)了SQSTM1的螯合活性和選擇性自噬。因此，作者重點(diǎn)研究了USP8對(duì)K420泛素化的影響。作者將420位的賴氨酸殘基突變?yōu)榫彼?，生成SQSTM1K420R突變體。作者將His-野生型SQSTM1或SQSTM1K420R突變體與USP8-Flag和HA-Ub一起轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞。與以前的報(bào)告一致，作者發(fā)現(xiàn)與野生型SQSTM1K420R突變體相比，附著在SQSTM1K420R突變體上的HA-Ub數(shù)量急劇減少。與野生型SQSTM1相比，USP8的過量表達(dá)對(duì)SQSTM1K420R突變體的泛素化沒有明顯影響。此外，SQSTM1K420R突變體顯示出與K11相連的泛素化減少。然而，野生型SQSTM1和SQSTM1K420R突變體擁有類似數(shù)量的K48和K63連接的泛素鏈，這表明K420沒有經(jīng)過K48或K63連接的泛素化修飾。正如預(yù)期的那樣，USP8的過量表達(dá)并不明顯影響SQSTM1K420R突變體的K48或K63連接的泛素化。最近，KEAP1（kelch-like ECH-associated protein 1）被證明在K420處泛素化SQSTM1，以增強(qiáng)SQSTM1的扣押活性和自噬降解。因此，作者試圖確定USP8是否與KEAP1競(jìng)爭SQSTM1在K420的泛素化。USP8的過表達(dá)削弱了由KEAP1過表達(dá)誘導(dǎo)的野生型SQSTM1的泛素化。在SQSTM1K420R突變體中沒有觀察到這種效果。因此，USP8拮抗KEAP1對(duì)SQSTM1在K420的泛素化作用?？傊?，這些結(jié)果表明，USP8主要是在K420處消除了SQSTM1的泛素化。

研究結(jié)論：USP8主要是在K420處消除了SQSTM1的泛素化。

?

5.USP8敲減促進(jìn)SQSTM1的自噬降解? ? ?

????????據(jù)報(bào)道，SQSTM1在K420處的泛素化可增強(qiáng)SQSTM1的自噬降解。USP8在K420殘基處對(duì)SQSTM1進(jìn)行去泛素化，因此作者推斷USP8可能調(diào)節(jié)SQSTM1的自噬降解。作者首先檢查了USP8過表達(dá)對(duì)SQSTM1蛋白豐度的影響。過量表達(dá)USP8，而不是USP8C786A突變體，增加了HEK293T細(xì)胞中內(nèi)源性SQSTM1蛋白的水平。此外，在MEFs中敲減內(nèi)源性Usp8會(huì)顯著減少SQSTM1蛋白的表達(dá)。

????????作者還測(cè)量了USP8對(duì)內(nèi)源性SQSTM1蛋白的半衰期的影響。作者用蛋白合成抑制劑環(huán)己酮（CHX）處理混雜的或Usp8敲減的MEFs。敲減Usp8明顯縮短了SQSTM1蛋白在MEF細(xì)胞中的半衰期，表明USP8在維持SQSTM1蛋白的穩(wěn)定性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。SQSTM1的降解主要是通過自噬介導(dǎo)的；因此，自噬途徑的中斷導(dǎo)致SQSTM1蛋白在細(xì)胞中的積累。正如預(yù)期的那樣，用BafA1處理后，MEFs中的SQSTM1蛋白水平增加。最后，作者發(fā)現(xiàn)Usp8敲減并沒有導(dǎo)致atg7./- MEFs中SQSTM1蛋白水平的降低，而這些細(xì)胞缺乏自噬功能。

研究結(jié)論：USP8保護(hù)SQSTM1免受自噬降解的影響。

?

6.USP8作為基礎(chǔ)自噬的負(fù)調(diào)節(jié)器發(fā)揮作用??? ?

????????SQSTM1在其UBA結(jié)構(gòu)域內(nèi)的K420處的泛素化增強(qiáng)了SQSTM1介導(dǎo)的泛素化底物被招募到自噬體中進(jìn)行降解。USP8在K420處對(duì)SQSTM1進(jìn)行去泛素化，并抑制其自噬降解，表明USP8可能在自噬體的形成和自噬通量中發(fā)揮重要作用。BafA1阻止自噬體-溶酶體的融合，隨后導(dǎo)致LC3-II的積累，LC3-II與自噬體膜緊密結(jié)合，是自噬的標(biāo)志。正如預(yù)期的那樣，BafA1處理導(dǎo)致了LC3-II的積累。過度表達(dá)USP8，但不表達(dá)USP8C786A突變體，會(huì)降低LC3-II的水平。作者接下來研究了USP8敲除對(duì)自噬的影響。與野生型對(duì)照組相比，在基礎(chǔ)條件下，HeLa細(xì)胞中的USP8敲除的LC3-II水平高得多。此外，與野生型對(duì)照組相比，BafA1處理導(dǎo)致USP8敲減的HeLa細(xì)胞中積累更多的LC3-II。

????????蛋白酶體抑制劑硼替佐米，可以誘發(fā)細(xì)胞中的SQSTM1聚集。K420的泛素化是形成SQSTM1聚集物的關(guān)鍵。在硼替佐米處理后，USP8敲減的HeLa細(xì)胞比野生型細(xì)胞形成更大的SQSTM1聚集物。

研究結(jié)論：USP8是基礎(chǔ)自噬的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)器。

?

7.USP8通過直接對(duì)SQSTM1的K420進(jìn)行去泛素化來調(diào)節(jié)SQSTM1的降解和自噬作用

????????自噬的激活可以誘導(dǎo)SQSTM1的降解，USP8可能調(diào)節(jié)其他底物來影響SQSTM1的降解和自噬。接下來，作者試圖研究USP8是否通過在K420處對(duì)SQSTM1進(jìn)行去泛素化來影響SQSTM1蛋白水平和自噬。敲減Usp8對(duì)sqstm1./- MEFs中LC3-II的水平?jīng)]有明顯影響，表明SQSTM1在USP8介導(dǎo)的自噬中起著關(guān)鍵作用。此外，使用shRNA從HEK293T細(xì)胞中去除內(nèi)源性SQSTM1，隨后將SQSTM1K420R突變體引入這些細(xì)胞，生成SQSTM1K420R突變表達(dá)的HEK293T細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)，USP8的過表達(dá)并沒有明顯改變這些細(xì)胞中SQSTM1K420R突變體和LC3-II的水平。

研究結(jié)論：USP8通過在K420處對(duì)SQSTM1進(jìn)行去泛素化調(diào)節(jié)SQSTM1的活性和自噬。

?

結(jié)論與討論

????????去泛素化酶(DUBs）是進(jìn)行蛋白泛素化的逆轉(zhuǎn)過程的蛋白酶。據(jù)報(bào)道，一些DUBs通過去泛素化自噬途徑的成分來調(diào)節(jié)自噬，例如，USP14通過負(fù)向控制BECN1的K63連接的多泛素化來調(diào)節(jié)自噬。USP19通過去泛素化BECN1來調(diào)節(jié)自噬和抗病毒免疫反應(yīng)。目前，SQSTM1的特異性去泛素化酶還沒有被確定。這里作者發(fā)現(xiàn), USP8直接與SQSTM1相互作用并對(duì)其進(jìn)行去泛素化，并在K420處去除SQSTM1的泛素化。USP8敲低導(dǎo)致SQSTM1的自噬降解和自噬通量增加。作者的研究確定了USP8是sQSTM1的一個(gè)關(guān)鍵和真正的去泛素化酶，同時(shí)，研究結(jié)果也驗(yàn)證了自噬受體的泛素化是控制選擇性自噬的一個(gè)重要調(diào)節(jié)機(jī)制的觀點(diǎn)。

?

Thank you!

?

原文鏈接：https://doi.org/10.1080/15548627.2019.1635381