背景介紹

泛素化是一種酶促的、蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，幾乎參與了真核生物細(xì)胞的所有生命活動(dòng)，如蛋白酶體依賴的蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞周期進(jìn)程、蛋白定位、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。泛素化過程是由泛素激活酶?(E1)、泛素結(jié)合酶?(E2)?和泛素連接酶?(E3)?級聯(lián)催化完成，最終將泛素分子加到底物蛋白上，從而影響底物蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、活性或者細(xì)胞定位等。E1、E2和E3的數(shù)量存在很大的差異，水稻中有6個(gè)E1，49個(gè)E2，1515個(gè)E3。在整個(gè)泛素化級聯(lián)反應(yīng)中E3泛素連接酶起決定底物特異性的作用，將泛素分子轉(zhuǎn)移到底物的某個(gè)賴氨酸上。通常情況下，泛素連接酶可以將目的蛋白質(zhì)多泛素化，即加上多個(gè)泛素分子，形成多泛素鏈，從而使帶有多泛素鏈的蛋白質(zhì)被蛋白酶體所識別和降解。但在一些情況下，泛素連接酶只在目的蛋白質(zhì)上連接一個(gè)泛素分子，這種單泛素化的蛋白質(zhì)不會(huì)被蛋白酶體降解，但其在細(xì)胞中的定位或功能卻可能發(fā)生改變，例如，單泛素化的蛋白質(zhì)可以通過結(jié)合其他具有泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)來改變自身位置。根據(jù)蛋白亞基結(jié)構(gòu)組成，E3分為兩大類，單亞基E3（HECT、RING、U-box）和多亞基E3（SCF (SKP1–CUL1–F-box)、 CUL3–BTB、CUL4–DDB1–DWD、APC/C）。

圖1 | 泛素化系統(tǒng)示例圖

泛素化的作用廣泛，在動(dòng)植物中均是研究熱點(diǎn)，水稻E3泛素連接酶對水稻生長發(fā)育等方面的調(diào)控作用也是水稻科研工作者的研究重點(diǎn)，近3年來發(fā)表的水稻E3文章已余百篇（部分見文末）。

為快速鑒定水稻泛素化蛋白的E3泛素連接酶，建立水稻泛素化互作組，促進(jìn)水稻科研工作發(fā)展，歐易生物攜手中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所寧約瑟老師團(tuán)隊(duì)，共同構(gòu)建了水稻泛素E3連接酶文庫，該文庫包含了約1500個(gè)E3泛素連接酶ORF，占目前已知所有E3連接酶基因總數(shù)的98.94%，包含單亞基和多亞基共7種類型，如下表。該文庫構(gòu)建于pGADT7載體上，可用于酵母雙雜交篩選蛋白底物對應(yīng)的特異性E3泛素連接酶。

基因序列數(shù)據(jù)來源：MSU Rice Genome Annotation Project Release 7 data

文庫參數(shù)：

·文庫構(gòu)建于pGADT7載體上，可用于酵母雙雜交篩選蛋白底物對應(yīng)的特異性泛素連接酶；

·包含約1500個(gè)E3泛素連接酶ORF；

·占目前已知所有E3連接酶基因總數(shù)的98.94%；

·包含單亞基和多亞基共7種類型，如下表：

表1 |?水稻泛素E3連接酶文庫組成

結(jié)果展示

該項(xiàng)工作成果于2022年7月，以“An ORFeome of rice E3 ubiquitin ligases for global analysis of the ubiquitination interactome”為題發(fā)表于Genome Biology。

文中詳細(xì)介紹了E3文庫的構(gòu)建方式、組成、注釋信息等，并使用已知的4種與水稻干旱、高鹽和抗病等相關(guān)的泛素化蛋白為誘餌，對泛素E3連接酶文庫進(jìn)行了篩選驗(yàn)證，結(jié)果利用該文庫可以高效的篩選到已知的和新的E3泛素連接酶，文中還通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對互作和蛋白降解進(jìn)行了驗(yàn)證。其中OsSKIPa共篩選到了51個(gè)互作陽性克隆，編碼11個(gè)E3泛素連接酶；OsNRPD1a共篩選到了92個(gè)互作陽性克隆，編碼8個(gè)E3泛素連接酶；NRR共篩選到了173個(gè)互作陽性克隆，編碼11個(gè) E3泛素連接酶；rRGA2.1共篩選到了85個(gè)互作陽性克隆，編碼7個(gè)E3泛素連接酶。此外，還利用該文庫鑒定了苯丙胺酶家族蛋白PALs的核心E3泛素連接酶OsFBK16，揭示了OsFBK16通過降解OsPALs負(fù)調(diào)控水稻抵抗稻瘟病的分子機(jī)制。

圖2 | 水稻泛素E3連接酶文庫組成篩選流程及驗(yàn)證

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