分析不同時(shí)間點(diǎn)的心肌梗死小鼠的骨髓和循環(huán)單核細(xì)胞的單細(xì)胞RNA-seq測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大致被定義為5個大的類群，7個組（圖1A-1C）。GO分析顯示單核細(xì)胞除了上調(diào)和放大心肌梗死后的炎癥反應(yīng)外，還迅速啟動修復(fù)過程，包括對血管生成和傷口愈合的反應(yīng)（圖1D）。同時(shí)會啟動一系列經(jīng)典修復(fù)基因的表達(dá)，包括心肌梗死后早期的Anxa6、F10、Lrg1和Tgfbi（圖1E）。心梗后單核細(xì)胞發(fā)育過程的擬時(shí)序分析表明，BM和循環(huán)單核細(xì)胞中的修復(fù)基因早期激活，并隨著時(shí)間的推移逐漸積累（圖1F和1G）。對假手術(shù)或第1天心肌梗死小鼠的循環(huán)單核細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定了心肌梗死后650個上調(diào)基因和203個下調(diào)基因，這表明循環(huán)單核細(xì)胞在到達(dá)受損心臟之前經(jīng)歷了早期和不同的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化（圖1H）。GO富集分析證實(shí)，修復(fù)基因的表達(dá)，包括參與血管系統(tǒng)發(fā)育、傷口愈合和細(xì)胞外基質(zhì)組織的基因，被廣泛和遠(yuǎn)程激活（圖1I）。在基于MCC方法的網(wǎng)絡(luò)中具有最高優(yōu)先級的10個基因中，修復(fù)基因Vegf-a和IL-10被鑒定為心梗后早期修復(fù)網(wǎng)絡(luò)中的潛在中樞基因（圖1J）。上述這些結(jié)果顯示單核細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上修復(fù)活性會及時(shí)啟動，并通過炎癥和修復(fù)基因的早期精細(xì)調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)對免疫環(huán)境的動態(tài)調(diào)節(jié)。

2. 心肌梗死后骨髓和循環(huán)單核細(xì)胞中的組蛋白乳酸化迅速升高

為了探討乳糖基化在心肌梗死后單核細(xì)胞修復(fù)基因的早期和遠(yuǎn)程激活中的作用，作者檢測了心肌梗死早期骨髓細(xì)胞和循環(huán)單核細(xì)胞以及心臟浸潤巨噬細(xì)胞中乳糖基的變化。Western印跡分析顯示，與對照小鼠相比，心梗小鼠的骨髓細(xì)胞和循環(huán)單核細(xì)胞中的總?cè)樗峄斤@著升高，并且在17kDa附近出現(xiàn)了一條主要的帶，這可能代表組蛋白H3（圖2A和2B）。免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示在小鼠心梗后4-24小時(shí)內(nèi)，不同時(shí)間點(diǎn)的單核細(xì)胞乳糖基化水平顯著上調(diào)，并在72小時(shí)前保持高水平的乳糖基化。相反，乙酰化水平在早期增加，并在MI后72小時(shí)內(nèi)迅速下降至基線水平（圖2C至2F）。作者檢測了先前鑒定的組蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）的水平，其顯示出與總體乳酸化水平相似的趨勢（圖2G至2J）。且H3K18la水平維持在高水平達(dá)7天，并在心梗后14天恢復(fù)到基線水平。與此一致，心梗后3天梗死心臟的免疫熒光染色顯示，整體乳糖基化和H3K18la水平顯著升高，激光共聚焦圖像顯示乳糖基在梗死區(qū)域巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核中定位（圖2K和2L）。

這些數(shù)據(jù)表明，心肌梗死后梗死心臟局部和遠(yuǎn)端外圍的單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出組蛋白乳酸化增加。

3.組蛋白乳酸化促進(jìn)心肌梗死后修復(fù)基因Lrg1、Vegf-a和IL-10的激活

為了篩選心梗中組蛋白乳酸化的候選靶基因，研究者使用H3K18la或抗H3K18la抗體對心梗后24小時(shí)的假手術(shù)小鼠和心梗小鼠中分選的循環(huán)單核細(xì)胞進(jìn)行CUT&Tag測定。數(shù)據(jù)顯示，H3K18la在基因的啟動子區(qū)和上游區(qū)富集（圖3A）。H3K17la修飾相關(guān)基因與心梗后的H3K18 ac顯著不同。這些基因中只有14%（4168個基因中的566個）顯示H3K18la和H3K118ac顯著增加，而63%的H3K19la標(biāo)記基因未顯示H3K18ac的明顯增加（圖3B和3C）。

此外，基因集富集分析表明，H3K18la結(jié)合的基因在很大程度上與血管生成和傷口愈合有關(guān)（圖3D）。為了鑒定心梗后單核細(xì)胞中H3K18la的靶基因，作者結(jié)合CUT&Tag和RNA-seq數(shù)據(jù)，根據(jù)基因的表達(dá)和H3K118la修飾將基因分為4類：上調(diào)基因有或無差異H3K17la，下調(diào)基因有或沒有差異H3K18la（圖3E）。通過對兩類H3K18la修飾基因的從頭基序搜索，作者發(fā)現(xiàn)H3K118la的上調(diào)和下調(diào)基因具有不同的富集DNA序列（圖3F）。GO分析顯示，心梗期間H3K18la修飾增加的上調(diào)基因參與血管生成的正調(diào)控（圖3G）。

RNAseq數(shù)據(jù)的熱圖地表明，參與血管生成過程的許多代表性基因（如Vegf-a、Lrg1和IL-10，它們也是H3K18la修飾升高的基因）在心梗后顯著上調(diào)（圖3H）。篩選具有上調(diào)的H3K18la修飾的前30個基因，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄上調(diào)進(jìn)行排序；Lrg1是最顯著上調(diào)的（圖3I）。因此，作者將Vegf-a、IL-10和Lrg1作為乳糖基化的潛在靶基因（圖3J）。RT-qPCR和ChIP-qPCR分析表明Vegf-a、IL-10和Lrg1啟動子區(qū)中的表達(dá)增加和H3K18la富集相關(guān)（圖3K和3L）。

4. H3K18la調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞靶基因的轉(zhuǎn)錄和修復(fù)活性

為了研究H3K18la對修復(fù)基因表達(dá)的直接影響，作者通過添加外源乳酸鹽或乳酸脫氫酶抑制劑FX-11處理細(xì)胞來控制骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMDMs）中的組蛋白乳酸化水平。用脂多糖（LPS）刺激BMDMs導(dǎo)致H3K18la水平升高（圖4A）。添加外源性乳酸鹽后，細(xì)胞內(nèi)乳酸鹽水平和組蛋白H3K18la水平升高（圖4B和4C）。ChIP qPCR表明靶基因啟動子區(qū)H3K18la富集增加，RT-qPCR結(jié)果證實(shí)了乳酸處理后靶基因表達(dá)上調(diào)（圖4D和4E）。同時(shí)，F(xiàn)X-11顯著抑制BMDM中的細(xì)胞內(nèi)乳酸和H3K18la水平（圖4F和4G）。ChIP qPCR和RT-qPCR表明FX-11治療后H3K18la強(qiáng)度和靶基因表達(dá)降低（圖4H和4I）。

乳酸鹽處理組的促炎M1巨噬細(xì)胞的百分比顯著降低，而FX-11處理組促炎M1巨噬細(xì)胞的百分比則升高（圖4J和4K）。用乳酸鹽處理的BMDMs的條件培養(yǎng)基與小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖增加（圖4L）并且遷移到小室或傷口區(qū)域（圖4M和4N）以及形成更有組織的分支和更長的管長度（圖4O）有關(guān)，表明H3K18la升高的單核細(xì)胞具有增強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞管形成能力?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明H3K18la促進(jìn)Lrg1、Vegf-a和IL-10的轉(zhuǎn)錄，并改善BMDM的抗炎和促血管生成雙重修復(fù)活性。

5.組蛋白乳酸化升高有利于修復(fù)環(huán)境并改善心肌梗死后的心臟功能

圖5A顯示了乳酸鈉治療心梗小鼠的實(shí)驗(yàn)方案。循環(huán)單核細(xì)胞和浸潤巨噬細(xì)胞中的H3K18la水平顯著升高（圖5B和5C），乳酸鈉處理的小鼠中Lrg1、Vegf-a和IL-10的mRNA水平升高（圖6D）。乳酸鈉治療后H3K18la的增加抑制了炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α（腫瘤壞死因子）的表達(dá)（圖5E）。升高的H3K18la抑制Ly6Chi炎性巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤（圖5F和5G）。蘇木精和伊紅染色證實(shí)，H3K18la增加導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤減少（圖5H）。CD31和α-SMA（α-平滑肌肌動蛋白）的免疫熒光染色表明，乳酸鈉誘導(dǎo)的H3K18la增加促進(jìn)了MI后的血管生成（圖5I，5J）。Masson三色染色顯示，乳酸鈉誘導(dǎo)的H3K18la增加抑制了過度的心肌纖維化和病理性心臟重塑（圖5K）。與對照組相比，H3K18la的增加改善了心梗后的射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)，表明H3K18la除了其抗炎和促血管生成作用外，還改善了心梗后的心臟功能障礙（圖5L至5N）。

總之，這些結(jié)果表明，心肌梗死后早期單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞的組蛋白乳酸化增強(qiáng)有利于修復(fù)環(huán)境，有助于改善心肌梗死后的心臟功能。

6.心肌梗死后循環(huán)單核細(xì)胞內(nèi)源性糖酵解重編程部分增加H3K18la的水平

研究表明，巨噬細(xì)胞糖酵解通過提供乳酸作為底物來調(diào)節(jié)組蛋白乳酸化。然而，心肌復(fù)張前單核細(xì)胞的代謝轉(zhuǎn)變及其在心肌梗死后調(diào)節(jié)乳糖化水平中的作用仍不清楚。因此，本文研究結(jié)果表明心肌梗死小鼠單核細(xì)胞糖酵代謝能力提高，基礎(chǔ)氧化磷酸化和備用呼吸能力降低，最大呼吸強(qiáng)烈降低，這意味著外周單核細(xì)胞更強(qiáng)烈地依賴于糖酵解，而不是心梗后的氧化代謝（圖6A至6D）。這些數(shù)據(jù)表明，單核細(xì)胞在MI后經(jīng)歷代謝重編程，這可能對依賴糖酵解的組蛋白乳酸化至關(guān)重要。

為了驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)代謝模式和細(xì)胞外代謝產(chǎn)物對乳酰化和乳?；嚓P(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，作者使用二氯乙酸鈉（DCA，丙酮酸脫氫酶激酶抑制劑）和魚藤酮（線粒體呼吸鏈復(fù)合物I的抑制劑）調(diào)節(jié)參與糖酵解途徑和線粒體呼吸鏈的關(guān)鍵酶的活性（圖6E）。用魚藤酮處理24小時(shí)后，BMDM中的細(xì)胞內(nèi)乳酸和H3K18la水平顯著升高，而在乳酸脫氫酶抑制劑FX-11的存在下則降低（圖6F和6G）。

ChIP-qPCR和RT qPCR結(jié)果表明，魚藤酮顯著增加了乳?；揎椇腿轷；谢騆rg1、Vegf-a和IL-10的表達(dá)（圖6H和6I）。相反，DCA處理后，BMDMs的細(xì)胞內(nèi)乳酸和H3K18la水平降低。向DCA處理的細(xì)胞中重新添加乳酸鹽成功地恢復(fù)了細(xì)胞內(nèi)乳酸鹽、組蛋白乳酸化水平和H3K18la修飾基因的表達(dá)（圖6J至6M）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞外乳酸鹽在組蛋白乳酸化中的作用，使用了乳酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MCT1（單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1）抑制劑AZD-3965。外源乳酸鹽的添加顯著增加了BMDM中的組蛋白乳化水平和靶基因表達(dá)，而MCT1抑制顯著抑制了外源乳酸鹽、，這表明細(xì)胞外環(huán)境中的乳酸鹽需要至少部分通過MCT1運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中，然后才能參與乳酸化（圖6N至6P）。

研究結(jié)論

本研究首先確了心肌梗死后小鼠的骨髓和循環(huán)單核細(xì)胞中的修復(fù)基因早期激活，而且發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞中的組蛋白乳酸化會迅速升高，而組蛋白乳酸化的升高促進(jìn)心肌梗死后修復(fù)基因如Lrg1、Vegf-a和IL-10的激活。證明了H3K18la調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞靶基因的轉(zhuǎn)錄和修復(fù)活性，組蛋白乳酸化升高有利于修復(fù)環(huán)境并改善心肌梗死后的心臟功能，還證明了心肌梗死后循環(huán)單核細(xì)胞的H3K18la的水平增加部分是由內(nèi)源性糖酵解重編程導(dǎo)致的。

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