簡(jiǎn)介

流式細(xì)胞術(shù)（Flow?cytometry，簡(jiǎn)稱FCM）是一種基于流式細(xì)胞儀通過(guò)檢測(cè)偶聯(lián)熒光信號(hào)快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞或者顆粒）的多項(xiàng)特性技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體進(jìn)行分選。早期流式細(xì)胞術(shù)主要用于定性，后續(xù)慢慢發(fā)展為多參數(shù)定性、定量以及分選的技術(shù)。

原理

其原理是在一組混合的細(xì)胞群中，加入特異的針對(duì)特定靶細(xì)胞表面分子的熒光標(biāo)記單克隆抗體，這種特異單克隆抗體與其對(duì)應(yīng)的抗原靶分子結(jié)合，結(jié)合后的熒光標(biāo)記抗體停留在特定細(xì)胞的表面，稱為熒光抗體標(biāo)記的靶細(xì)胞；將含有被標(biāo)記細(xì)胞的混合細(xì)胞群混懸在一定容積的上樣緩沖液中，再通過(guò)FACS的進(jìn)樣吸管孔，儀器就會(huì)將細(xì)胞懸液制成以單細(xì)胞排列的微細(xì)流束。

液流系統(tǒng)

光溜系統(tǒng)

常見(jiàn)的流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用

01

細(xì)胞群比例測(cè)定以及表型測(cè)定

運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定某細(xì)胞群體或者細(xì)胞亞群的比例是其最基本功能。要完成細(xì)胞群比例測(cè)定我們需要明確：要測(cè)定的總體是什么，例如免疫細(xì)胞的特征表型是CD45,T細(xì)胞的特征表型是CD3，由此我們可以得到一群CD45+CD3+ 或者CD45+CD3-細(xì)胞，同理我們也可以對(duì)得到的這群細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步劃分，最終得到我們的目標(biāo)細(xì)胞群比例測(cè)定或者是表型測(cè)定。

02

細(xì)胞表面分子、胞內(nèi)抗原的檢測(cè)與分析

選擇與熒光素偶聯(lián)的抗體或使用一抗和與熒光素偶聯(lián)的二抗，通過(guò)抗原抗體結(jié)合原理，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)細(xì)胞表面分子、胞內(nèi)抗原表達(dá)量的目的，并可以作為一種抗體開(kāi)發(fā)質(zhì)控檢測(cè)手段。

03

細(xì)胞DNA倍體與周期檢測(cè)與分析

細(xì)胞周期（cell cycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段，是細(xì)胞從2倍體到4倍體再分裂成2倍體的過(guò)程。

碘化丙啶（Propidium Iodide,?PI）是一種核酸染料。可以與DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。因此，通過(guò)流式細(xì)胞儀PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/G0，S和G2/M三期，從而可通過(guò)流式直方圖對(duì)各時(shí)相細(xì)胞百分率進(jìn)行分析。

04

細(xì)胞凋亡的檢測(cè)與分析Annexinv/PI雙染法

細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，可快速準(zhǔn)確的得到細(xì)胞處于早期、晚期凋亡的細(xì)胞比例，反映藥物處理對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響。

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V進(jìn)行熒光素（EGFP、FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細(xì)胞在其中，甚至機(jī)械損傷的細(xì)胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果越不可信，建議實(shí)驗(yàn)中盡量控制這一象限細(xì)胞比例。

Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。

Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。

Q4：(AnnexinV-染料)-/PI--，此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。

05

分離純化

流式分選術(shù)應(yīng)用的運(yùn)用解決了細(xì)胞學(xué)研究中一個(gè)很重要的課題分離純化，尤其是需要研究細(xì)胞功能時(shí)，如收集細(xì)胞培養(yǎng)上清通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，細(xì)胞共培養(yǎng)檢測(cè)細(xì)胞的功能等，都需要得到高純度的細(xì)胞。

多重?zé)晒鈽?biāo)記的流式細(xì)胞分選技術(shù)檢測(cè)小鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量

寫(xiě)在最后——流式實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵

減少非特異熒光染色

細(xì)胞的活性和狀態(tài)：流式細(xì)胞儀不但可探測(cè)細(xì)胞表面的熒光，也可探測(cè)細(xì)胞內(nèi)的熒光。因此，如果要檢測(cè)細(xì)胞表面的分子，一定要保證細(xì)胞的活性，還應(yīng)盡可能保持細(xì)胞靜止，通常在4度進(jìn)行操作。否則，熒光抗體進(jìn)入死細(xì)胞內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生非特異結(jié)果。

封閉抗體的應(yīng)用是必不可少的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的免疫細(xì)胞表面都表達(dá)有Fc-R。細(xì)胞與抗體相互作用后，一定要用FACS緩沖液洗2~3次，以除去游離的抗體。

單染色時(shí)以FACS最常用，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗體熒光比較穩(wěn)定而且價(jià)格合適。

如果同時(shí)要檢測(cè)兩種以上的分子，一定要選擇不同波長(zhǎng)的熒光所標(biāo)記的抗體。