毋庸置疑，線粒體是近年的研究熱點(diǎn)，特別是和各種細(xì)胞死亡相整合，都快殺瘋了。這么大個(gè)IP，小云也不遺余力的給大家進(jìn)行了多次推薦。

對(duì)于尚有遲疑的人，其最大的擔(dān)心點(diǎn)必然是---我研究的方向是否和線粒體有關(guān)？或者說(shuō)，我這個(gè)方向能否挖掘到與線粒體相關(guān)的顯著差異基因了？

針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，小云的想法分為2方面：

1，理論層面: 線粒體是細(xì)胞中生產(chǎn)能量的主要場(chǎng)所，參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)，線粒體穩(wěn)態(tài)對(duì)維持正常的細(xì)胞功能至關(guān)重要。絕大部分疾病的發(fā)病和治療過(guò)程均涉及到細(xì)胞功能的變化，因此，與線粒體直接或者間接相關(guān)的研究數(shù)量自然很多。

2，技術(shù)層面：線粒體功能復(fù)雜，涉及基因數(shù)量巨大，能獲得顯著差異基因概率高。

小云今天找到1篇8分+分析線粒體基因與胃癌的文章，該文章并未將線粒體基因與細(xì)胞死亡進(jìn)行關(guān)聯(lián)，而是從腫瘤微環(huán)境、免疫浸潤(rùn)等角度來(lái)討論線粒體基因的功能；同時(shí)，該文章列舉出了2030個(gè)線粒體基因，可謂是最豐富的版本，為大家的分析提供了參考（有需要基因集的粉絲，可以回復(fù)關(guān)鍵詞XXX獲取）。下面，我們一起看看這篇文章吧（如果沒(méi)有分析思路或者文獻(xiàn)復(fù)現(xiàn)有困難，可以找小云，超多創(chuàng)新性高的分析思路和分析服務(wù)供你選擇?。?/span>。?

題目：構(gòu)建線粒體相關(guān)基因特征以評(píng)估腫瘤免疫微環(huán)境并進(jìn)行胃腺癌的生存預(yù)測(cè)

雜志：Journal of translational medicine

影響因子：8.44

發(fā)表時(shí)間：2023年3月

研究思路

基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的STAD表達(dá)譜及芯片數(shù)據(jù)，利用“l(fā)imma”包獲得差異表達(dá)基因(DEGs)；將DEGs與線粒體相關(guān)基因取交集，獲得2031個(gè)差異表達(dá)的線粒體基因；通過(guò)單變量Cox回歸、Lasso回歸分析和多變量Cox回歸分析篩選線粒體相關(guān)基因，構(gòu)建新的預(yù)后相關(guān)基因集，利用基因集將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組；對(duì)高/低風(fēng)險(xiǎn)組患者的差異基因進(jìn)行GO、KEGG和GSEA富集分析；基于“ESTIMATE”包計(jì)算高/低風(fēng)險(xiǎn)組患者的腫瘤微環(huán)境分?jǐn)?shù)和免疫評(píng)分；使用R包的CIBERSORT算法計(jì)算高/低風(fēng)險(xiǎn)組患者中22種腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞(TIIC)的豐度；使用R包“pRRophetic”計(jì)算患者對(duì)138種化療/靶向療法藥物反應(yīng)的能力；最后利用qPCR法檢測(cè)4種線粒體相關(guān)特征基因在臨床患者和細(xì)胞系中的表達(dá)（圖1）。

圖1，本研究的分析流程圖

主要結(jié)果

1.?STAD中與線粒體相關(guān)的DEGs的鑒定和風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建

對(duì)上述3個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行DEG（差異表達(dá)基因）分析，共獲得2145個(gè)可編碼的DEGs（圖2A）；進(jìn)一步將GSEA中篩選出的線粒體相關(guān)基因和上述DEGs進(jìn)行了聯(lián)合分析，共篩選出STAD中的183個(gè)候選線粒體相關(guān)DEGs（圖2B）；通過(guò)單因素Cox回歸分析篩選出19個(gè)基因作為STAD患者預(yù)后的潛在危險(xiǎn)因素（圖2C）。利用LASSO回歸分析、多變量Cox回歸分析最終確認(rèn)出4個(gè)備選基因（圖2D，E）。與正常組織相比，分別在腫瘤樣本中觀察到較高的NOX4和FKBP10表達(dá)以及較低的ALDH3A2和MAOA表達(dá)（圖2F）。（ps：差異基因分析和火山圖可以用小云新開(kāi)發(fā)的零代碼生信分析小工具實(shí)現(xiàn)，云生信分析工具平臺(tái)包含超多零代碼分析和繪圖小工具，上傳數(shù)據(jù)一鍵出圖，感興趣的小伙伴歡迎來(lái)嘗試喲，網(wǎng)址：http://www.biocloudservice.com/home.html）。

圖2.STAD中與線粒體相關(guān)的DEGs的鑒定和風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建

利用患者的4個(gè)線粒體相關(guān)DEGs基因集的中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)亞組。K-M曲線顯示高危組患者的OS較差（P?=0.0009，圖3A）。ROC曲線證明了預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的準(zhǔn)確性（圖3B）。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與生存時(shí)間、生存狀態(tài)和風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)之間的關(guān)系證明了風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)后作用（圖3C）。GSE66229和GSE15459數(shù)據(jù)集進(jìn)一步驗(yàn)證了預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的穩(wěn)健性（圖3D）。在GSE66229數(shù)據(jù)集中，1年、3年和5年生存率的ROC曲線的AUC值分別為0.620、0.625和0.601（圖3E）。

圖3.與線粒體相關(guān)的DEGs風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建和驗(yàn)證

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1.?高危和低危人群DEGs功能富集分析

對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)患者組的298個(gè)DEG進(jìn)行了GO分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在含膠原蛋白的ECM（細(xì)胞外基質(zhì)）和膠原蛋白三聚體中（圖4A)。KEGG分析得到的前10條通路依次為：蛋白質(zhì)消化吸收、癌蛋白多糖、粘著斑、人乳頭瘤病毒感染、PI3K-Akt信號(hào)通路、ECM-受體相互作用、細(xì)胞粘附分子、軸突導(dǎo)向、cAMP信號(hào)通路、血管平滑肌收縮（圖4B）。GSEA結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與高風(fēng)險(xiǎn)組的ECM糖蛋白、核心基質(zhì)體、ECM組織顯著相關(guān)（圖4C）。

圖4.高危和低危人群DEGs功能富集分析

3.?線粒體相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與 STAD 中的免疫特征和免疫治療反應(yīng)相關(guān)

對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)患者組的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)高危組幼稚B細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、M0巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞含量顯著升高（圖5A）。ESTIMATE結(jié)果顯示，與低危組患者相比，高危組患者的免疫評(píng)分更高，腫瘤純度顯著降低（P=0.370）（圖5C、D)。由此，作者推測(cè)激活的CD8+T細(xì)胞特征與基質(zhì)體和CAF特征呈負(fù)相關(guān)，提示腫瘤免疫抑制微環(huán)境可能導(dǎo)致高危組STAD患者預(yù)后較差。分析發(fā)現(xiàn)，43個(gè)免疫檢查點(diǎn)在高風(fēng)險(xiǎn)組中受到顯著調(diào)節(jié)（圖5E）。

圖5線粒體相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與 STAD 中的免疫特征和免疫治療反應(yīng)相關(guān)

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作者進(jìn)一步使用TIDE算法來(lái)評(píng)估基于線粒體相關(guān)基因的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在預(yù)測(cè)STAD免疫治療反應(yīng)中的能力。結(jié)果表明，高危組的免疫治療反應(yīng)率明顯低于低危組（圖?6A）。應(yīng)用PRJEB25780隊(duì)列（PD-L1抑制劑治療45名晚期胃癌患者）來(lái)驗(yàn)證線粒體相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)特征的結(jié)果與TIDE的預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖6B）。在免疫評(píng)分較低的亞組中，低危組的免疫治療反應(yīng)率明顯高于高危組，表明將患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和免疫評(píng)分相結(jié)合是一種更有效的預(yù)測(cè)方法（圖6C、D）。

圖6線粒體相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與 STAD 中的免疫特征和免疫治療反應(yīng)相關(guān)

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4.?不同風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分STAD患者對(duì)治療效果的預(yù)測(cè)

作者預(yù)測(cè)了138種藥物（包括化療、靶向治療和免疫治療）對(duì)不同風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組STAD患者的效力，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組患者可能對(duì)雷帕霉素、PD-0325901、達(dá)沙替尼等更敏感，而低風(fēng)險(xiǎn)組患者可能對(duì)AZD7762、CEP-701、甲氨蝶呤等更敏感，可為臨床治療提供可靠參考（圖7）。

圖7. 不同風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分STAD患者對(duì)治療效果的預(yù)測(cè)

5.?對(duì)STAD中線粒體相關(guān)hub基因的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

作者收集了10對(duì)STAD患者的癌與癌旁組織進(jìn)行了qRT-PCR。如圖8A所示，STAD腫瘤組織中NOX4和FKBP10的表達(dá)分別顯著高于成對(duì)的相鄰正常組織；ALDH3A2和MAOA在STAD腫瘤組織中的表達(dá)分別顯著低于成對(duì)的相鄰正常組織。相比于正常胃上皮細(xì)胞，上述4個(gè)基因在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)量與臨床組織樣本中均一致（圖8B），表明了這四個(gè)線粒體相關(guān)基因的可靠性。

圖8. 對(duì)STAD中線粒體相關(guān)hub基因的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

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總結(jié)

這篇文章的分析內(nèi)容比較豐富，主要的特征是在篩選線粒體相關(guān)基因后，并未將線粒體基因與細(xì)胞死亡（鐵死亡、自噬、銅死亡）進(jìn)行關(guān)聯(lián)，而是從線粒體相關(guān)基因與腫瘤微環(huán)境、免疫浸潤(rùn)等角度來(lái)討論，且文章給出的2030個(gè)線粒體基因相對(duì)完整，可用于大家后續(xù)的分析。文章最后還加入了驗(yàn)證試驗(yàn)，這種干濕結(jié)合的方式可以學(xué)習(xí)起來(lái)，是現(xiàn)在發(fā)文的趨勢(shì)哦！