哈嘍，親愛的小伙伴們，我們又見面啦，繼最近一周阿爾茲海默癥系列文獻(xiàn)分享之后，此次給大家?guī)淼氖强蒲蓄I(lǐng)域的“明星”外泌體在阿爾茲海默癥中的研究案例，接下來我們一起看看外泌體如何助力阿爾茲海默癥相關(guān)細(xì)胞類型分析！

研究背景

阿爾茨海默?。ˋD）是一種普遍存在的神經(jīng)退行性腦病，其特征是大腦中存在淀粉樣斑塊和tau神經(jīng)原纖維纏結(jié)，但在斑塊沉積過程中分子和細(xì)胞變化仍然難以捉摸。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的每種細(xì)胞都分泌外泌體(EV)，其內(nèi)容物隨著AD疾病狀態(tài)而發(fā)生改變，可以反映疾病特異性的分子特征。從患者來源的生物流體或活檢中捕獲細(xì)胞類型特異性EV，并分析其內(nèi)容作為研究AD病理生理學(xué)的一種新方法，大多項(xiàng)目對患者血漿或血清中免疫捕獲腦細(xì)胞衍生的EVs進(jìn)行了研究，但由于人類樣本中細(xì)胞類型特異性EV蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集的信息目前有限，因此缺乏細(xì)胞特異性EV標(biāo)記物。

為解決以上問題，Tsuneya Ikezu研究團(tuán)隊(duì)在J Extracell Vesicl（IF 21.224）雜志上發(fā)表了題為“Human neural cell type-specific extracellular vesicle proteomedefines disease-related molecules associated with activated astrocytes in Alzheimer’s disease brain”的文章，證明了細(xì)胞類型特異性EV在評估AD進(jìn)展中的重要作用，并為未來神經(jīng)退行性疾病的EV研究提供了資源。

主要研究內(nèi)容如下：

1.研究了干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的四種不同的神經(jīng)細(xì)胞類型（興奮性神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞）分泌的EV的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，確定了新的細(xì)胞類型特異性EV蛋白標(biāo)記物。

2.使用臨床組織樣本證明細(xì)胞類型特異性EV實(shí)用性即如何參與阿爾茨海默?。ˋD），并進(jìn)行了蛋白質(zhì)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，生成了與不同功能和腦細(xì)胞類型相關(guān)的AD腦源性EV蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

技術(shù)手段：外泌體-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)-TMT蛋白質(zhì)組學(xué)-WGCNA分析（青蓮百奧可提供)

研究思路

結(jié)果展示

1.hiPSC衍生腦細(xì)胞分化和特性結(jié)果

作者首先利用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)分化成四種神經(jīng)細(xì)胞類型：星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，并通過RT-PCR和細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物驗(yàn)證這四種分化細(xì)胞的有效性，并通過ELISA方法對這些分化的細(xì)胞進(jìn)行了功能的表征。隨后，利用非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)（LFQ）分析了四種類型細(xì)胞的蛋白表達(dá)譜，結(jié)果展示共鑒定到3206個蛋白（圖1g），發(fā)現(xiàn)四種分化神經(jīng)細(xì)胞分別對應(yīng)的特異性蛋白標(biāo)志物的表達(dá)量均比較高，這揭示了hiPSC向主要腦細(xì)胞類型的分化有效性。

2.hiPSC衍生腦細(xì)胞外囊泡的分離與鑒定

作者從hiPSC分化的的四種類型的神經(jīng)細(xì)胞中利用超速離心法分離胞外囊泡(EV)，通過透射電子顯微鏡和納米顆粒追蹤分析方法對EV進(jìn)行了表征。為了比較不同細(xì)胞類型的EV蛋白質(zhì)組成，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜平臺進(jìn)行針對胞外囊泡的非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)（LFQ）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)非EV蛋白在EV中未檢測到，從而證明從hiPSC衍生的腦細(xì)胞中分離的EV組分質(zhì)量良好，具有高純度。為了進(jìn)一步確定人類神經(jīng)細(xì)胞衍生EV中普遍存在的泛EV標(biāo)記候選物，比較了在不同細(xì)胞類型的EV中發(fā)現(xiàn)的高度代表性蛋白質(zhì)，（CD9、CD63和CD81）、（PDCD6IP/ALIX）、（TSG101）、（SDCBP）（FLOT1）和（FLOT2）。此外，根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，作者研究了在不同細(xì)胞類型的EV中發(fā)現(xiàn)的高度代表性蛋白質(zhì)，利用所有EV樣本中重復(fù)率篩選到了16個在四種分化神經(jīng)細(xì)胞中均同時(shí)表達(dá)的蛋白，這些分子將有助于未來開發(fā)潛在的泛腦EV標(biāo)記物。

3.神經(jīng)細(xì)胞類型特異性EV蛋白質(zhì)組的比較

作者為了進(jìn)一步確定從hiPSC衍生神經(jīng)細(xì)胞分離的EV蛋白質(zhì)組成差異，作者利用iBAQ比較了不同細(xì)胞類型囊泡蛋白的豐度。主成分分析（PCA）和相關(guān)系數(shù)結(jié)果顯示不同EV蛋白組成具有細(xì)胞類型特異性，在不同細(xì)胞類型的EV樣本中表現(xiàn)出良好的區(qū)分性，表明EV具有良好的生物再現(xiàn)性和潛在的細(xì)胞類型特異性蛋白質(zhì)特征。根據(jù)聚類分析結(jié)果篩選到了不同細(xì)胞類型特異性的差異表達(dá)EV蛋白（圖3c）,他們參與了不同的生物過程（GO）和KEGG通路（圖3d），如星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes）特異的EV蛋白主要富集在與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)過程（包括細(xì)胞粘附、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用和整合素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)）以及生物代謝相關(guān)通路（包括糖酵解、丙酮酸代謝過程、膽固醇穩(wěn)態(tài)、氨基酸的生物發(fā)生和碳代謝）。少突膠質(zhì)細(xì)胞（iOligo）EV中豐富的生物過程和途徑涉及鐵離子穩(wěn)態(tài)和溶酶體功能?？傊?，這些比較分析可能代表了外泌體中捕獲的每種細(xì)胞類型特有的不同細(xì)胞功能?？傊?，這些比較分析可能代表了外泌體中捕獲的每種細(xì)胞類型特有的不同細(xì)胞功能。

4.hiPSC衍生的細(xì)胞類型特異性EV蛋白的鑒定

鑒于在不同的hiPSC衍生的神經(jīng)細(xì)胞類型中觀察到EV蛋白特征，故作者進(jìn)一步篩選特定的特異性蛋白作為腦源EV的細(xì)胞類型特異性生物標(biāo)記物。利用細(xì)胞類型內(nèi)蛋白質(zhì)豐度相對于其他細(xì)胞類型的倍數(shù)變化進(jìn)行初步篩選（圖4a-b），得到細(xì)胞類型特異性EV蛋白質(zhì)列表，顯示iNeuron EV中共有30種蛋白質(zhì)，iMGL EV中有70種蛋白質(zhì)，iAtrocyte EV中有300種蛋白質(zhì)，以及iOligo EV中的14種蛋白質(zhì)。隨后通過免疫印跡法從健康對照組和AD患者中分離出腦源性EV樣本進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(圖4c-4d)，最終確定將NCAM1, ATP1A3作為神經(jīng)元EV的標(biāo)志物, LRP1, ITGA6, EAAT1作為星形膠質(zhì)細(xì)胞EV的標(biāo)志物, LCP1作為小膠質(zhì)細(xì)胞EV的標(biāo)志物, LAMP2, FTH1和 MOG 作為少突膠質(zhì)細(xì)胞EV標(biāo)志物。整個數(shù)據(jù)提供了不同腦細(xì)胞類型中細(xì)胞類型特異性EV蛋白的直接證據(jù)，可用于開發(fā)從人類生物流體和組織中分離人類神經(jīng)細(xì)胞類型特異性EV的新標(biāo)記物。

5.人腦組織衍生EV的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

為了加強(qiáng)蛋白組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)以及探索其潛在的臨床應(yīng)用，作者對11名健康對照(HC)、8名輕度認(rèn)知障礙患者(MCI)和11名AD患者的腦組織進(jìn)行不連續(xù)蔗糖梯度超速離心法富集EV，隨后進(jìn)行了TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)分析（圖5a），共鑒定到4286個腦源性EV蛋白（其中2645個為共有蛋白），差異比較分析篩選到242個顯著改變的蛋白（圖5c）。生信分析顯示AD中這些上調(diào)的DEPs與細(xì)胞外基質(zhì)、白細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)運(yùn)和整合素介導(dǎo)的信號通路有關(guān)，而下調(diào)的DEPs與DNA損傷識別、蛋白質(zhì)折疊和Cullin去乙酰化相關(guān)。作者利用P值和FC篩選到了多個疾病特異性差異表達(dá)蛋白，共確定了42個DEP，AD-EV特異性變化大部分與AD密切相關(guān)，最終為區(qū)分從HC、MCI和AD大腦中分離出來的EV提供了可能（圖5e）。

6.具有細(xì)胞類型特異性的AD-EV蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

應(yīng)用WGCNA構(gòu)建了一個使用2645種常見蛋白質(zhì)的AD-EV蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，幫助確定疾病相關(guān)的關(guān)鍵分子途徑和潛在治療靶點(diǎn)。結(jié)果表明從共表達(dá)的蛋白質(zhì)組中鑒定了11個模塊，并將模塊特征蛋白與AD的神經(jīng)病理學(xué)特征（臨床癡呆、斑塊負(fù)荷、神經(jīng)纖維纏結(jié)負(fù)荷）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，三個模塊（M1、M6和M9）與所有三個AD性狀均呈負(fù)相關(guān)，其中M7模塊（與質(zhì)膜的固有成分相關(guān)）與AD病理特征成最強(qiáng)的正相關(guān) (圖6b）。

作者進(jìn)一步評估了腦源性EV蛋白的每個共表達(dá)模塊中細(xì)胞類型標(biāo)記物的富集情況，發(fā)現(xiàn)在M7模塊顯著富集星形膠質(zhì)細(xì)胞EV標(biāo)記物，且與AD性狀顯著正相關(guān)，意味著星形細(xì)胞來源的EV蛋白標(biāo)志物或許可作為AD的生物標(biāo)志物（圖6c）。此外與HC相比，M4、M6和M7模塊在MCI樣本中的增加或減少趨勢與AD樣本中相同，這意味著細(xì)胞粘附組裝、細(xì)胞對氮饑餓的反應(yīng)以及質(zhì)膜固有成分的變化發(fā)生在AD臨床前階段的早期。

7.M7/星形膠質(zhì)細(xì)胞模塊在激活的星形細(xì)胞來源的EV標(biāo)記物中富集，并與AD病理相關(guān)

由于M7模塊與AD特征和星形膠質(zhì)細(xì)胞來源EV的相關(guān)性最強(qiáng)，因此進(jìn)一步驗(yàn)證了M7模塊是否與激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的EV相關(guān)。結(jié)果顯示M7模塊在有活性的星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的EV中顯著富集（圖7a），M7模塊中激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生EV標(biāo)記物與前10個hub蛋白密切相互作用（圖7b），進(jìn)一步探索這些EV蛋白在M7中的潛在生物學(xué)功能和上游通路，我們進(jìn)行了通路分析，確定了與內(nèi)吞作用、整合素信號和NF-B激活相關(guān)的多個重要典型途徑。此外，探究了M7星形膠質(zhì)細(xì)胞模塊中的EV蛋白是否與AD病理相關(guān)，重點(diǎn)關(guān)注M7內(nèi)激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生EV標(biāo)記物（CAV1、ICAM1和ITGA5）和hub蛋白（ITGB1），利用免疫沉淀實(shí)驗(yàn)分析了5名HC和5名AD患者中活性星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的EV標(biāo)志物與M7模塊中的中心蛋白(ITGB1)的相互作用。上述結(jié)果表明在AD發(fā)病機(jī)制中，M7星形膠質(zhì)細(xì)胞模塊中的EV蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮主導(dǎo)作用，鑒定出的M7 EV蛋白(如ITGB1)，特別是在星形細(xì)胞特異性EV中，可作為潛在的AD生物標(biāo)志物。

總結(jié)

本文研究了四種不同的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的神經(jīng)細(xì)胞分離的EV蛋白質(zhì)組學(xué)特征，篩選出16個泛EV候選標(biāo)記物，并最終確定了新的細(xì)胞類型特異性EV蛋白標(biāo)記物，后續(xù)利用臨床組織樣本探索了EV蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與AD性狀的相關(guān)性，為未來以細(xì)胞類型特異性方式分析EV在神經(jīng)退行性疾病中的功能提供了豐富的資源。