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Nidogen-2是200kDa的基膜糖蛋白，在維持VSMC收縮表型和抑制損傷后再狹窄中起關(guān)鍵作用。本篇在研究Nidogen-2在血管鈣化中的作用。

Result1：Nidogen-2在鈣化VSMC和動(dòng)脈中的表達(dá)降低

高磷鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)VSMC鈣化，在第3/5/7天時(shí)觀察到NID2表達(dá)降低，而一些成骨標(biāo)志物，例如Runx2、BMP2、Msx2表達(dá)升高。

誘導(dǎo)了三種動(dòng)脈鈣化小鼠模型，觀察到了同樣的情況

取血清肌酐高的患者的腹主動(dòng)脈組織，染色證實(shí)Von Kossa含量減少。NID2降低與Runx2升高有顯著相關(guān)性。

Result2：NID2缺乏在體內(nèi)及體外均可加重血管鈣化

在VSMC中，用siRNA敲低NID2并不會(huì)導(dǎo)致自發(fā)鈣化，而加重了高磷誘導(dǎo)的鈣化。

而在培養(yǎng)基中添加NID2能夠緩解高磷誘導(dǎo)的鈣化。

誘導(dǎo)慢性腎衰竭模型，NID2缺乏小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的鈣化

這些共同表明，NID2缺乏加重血管鈣化。

Result3：NID2是LGR4的新型內(nèi)源性配體

將NID2與VSMC膜受體孵育，通過抗flag抗體特異性免疫沉淀的蛋白進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到的蛋白經(jīng)過兩輪GO分析，篩選出3種NID2最可能的結(jié)合的蛋白。而這三種蛋白中，只有LGR4在動(dòng)脈中有表達(dá)，因此聚焦于LGR4。

LGR4是一種GPCR，屬于LGR家族的B組，被認(rèn)為是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

為了證實(shí)NID2與LGR4之間的相互作用，將Flag-NID2和His-LGR4共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，證實(shí)二者的相互作用。

流式分析表明，NID2與LGR4特異性相互作用，而不與LGR5相互作用。

SPR實(shí)驗(yàn)證明二者的劑量依賴性結(jié)合。

克隆不同區(qū)段證明結(jié)合位點(diǎn)

Result4：NID2通過LGR4抑制血管鈣化

使用shRNA敲低LGR4，能夠加重高磷誘導(dǎo)的血管鈣化，并且完全消除NID2的保護(hù)作用。

SMC特異性敲除LGR4，能夠加重高磷誘導(dǎo)的血管鈣化，并且完全消除NID2的保護(hù)作用。

Result5：NID2通過?LGR4-Gαq-PKC信號(hào)傳導(dǎo)抑制血管鈣化

LGR4的已知配體RSPO1參與β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)，于是將RSPO1作為陽性對(duì)照與NID2相比，發(fā)現(xiàn)NID2并不具有劑量依賴性增加β-catenin表達(dá)的效果。

接下來想到NID2是否激活了LGR4的GPCR信號(hào)，BERT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了NID2刺激顯著誘導(dǎo)Gαq和Gβγ以劑量依賴的方式分離。

TGFα脫落實(shí)驗(yàn)：在配體刺激下，堿性磷酸酶標(biāo)記的TGFα (AP-TGFα)膜結(jié)合形式的外胞域脫落并釋放到條件培養(yǎng)基中。AP-TGFα的脫落反應(yīng)幾乎只發(fā)生在Gα12/13和Gαq信號(hào)的下游。

因此，NID-2可以像RANKL一樣以劑量依賴的方式增加AP-TGFα的釋放，表明LGR4下游的g - αq被激活。

NID-2引起的鈣信號(hào)的改變可以被LGR4沉默所阻斷

NID2引起的PKC磷酸化改變也可以被LGR4沉默所阻斷。

但不會(huì)引起β-arrestin改變

無論是Gαq抑制劑YM254890還是PKC抑制劑Go6983，均可顯著消除NID-2對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠原發(fā)性VSMC鈣化的保護(hù)作用

Result6：NID-2通過LGR4-PKCα-AMPKα1信號(hào)通路促進(jìn)Runx2?SUMOylation

首先，判斷PKCα是否在NID-2的下游發(fā)揮作用。與我們的假設(shè)一致，NID-2對(duì)高磷酸鹽誘導(dǎo)的VSMC鈣化的保護(hù)作用被PKCα抑制劑Go6976所消除

此外還做了一些沉默，就略去不說了。

研究這一部分的原因是觀察到鈣化標(biāo)志物Runx2在鈣化VSMC中降低，但NID-2并沒有改變Runx2的mRNA水平。

先前有報(bào)道稱，VSMCs AMPKα1的激活通過小泛素樣修飾物(SUMO, SUMOylation)促進(jìn)Runx2蛋白酶體降解并降低Runx2蛋白的表達(dá)。于是推測(cè)NID-2治療鈣化VSMCs中Runx2的減少是否由于其SUMOylation。

PKCα抑制劑Go6976可以消除這一修飾

NID-2處理下AMPK的異常激活能夠被LGR4沉默和PKCα抑制劑Go6976所逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，NID-2通過LGR4-PKCα-AMPKα1信號(hào)通路促進(jìn)Runx2 SUMOylation，從而起到對(duì)血管鈣化的保護(hù)作用。

DISCUSSION

?nidogen-2/Jagged-1/Notch3信號(hào)是否參與VSMC鈣化？