作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的核心成員，抗體在對付病原體方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在抗體產(chǎn)生過程中，初級抗體庫是通過V(D)J重排產(chǎn)生的，對抗原的親和力相對較低。之后，由AID胞苷脫氨酶啟動的體細(xì)胞超突變（SHM）會在抗體編碼序列中引入突變，提升抗體對抗原的親和力，從而實現(xiàn)抗體的親和力成熟。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，超突變在抗體可變區(qū)的外顯子上并非均勻分布，而是集中在三個非連續(xù)的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）。早在20世紀(jì)80年代，科學(xué)家們便提出了超突變?yōu)槭裁淳哂衅眯缘膯栴}，但四十多年來，這仍然是一個謎。

中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心孟飛龍團(tuán)隊和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所葉菱秀團(tuán)隊近日在《Cell》雜志上發(fā)表題為“Mesoscale DNA feature in antibody-coding sequence facilitates somatic hypermutation”的論文，揭示了CDR區(qū)域通過高度柔性的特征引發(fā)高頻突變的分子機(jī)制。這項研究為優(yōu)化抗體發(fā)現(xiàn)和設(shè)計新一代的人源化動物模型打下了基礎(chǔ)。

研究材料與方法

在這項研究中，研究人員構(gòu)建了攜帶IgVH-亂序等位基因的小鼠模型以及CDR3序列改變和FR3序列改變的小鼠模型（其中IgVH-FR3TAC乘客等位基因小鼠模型由賽業(yè)生物提供）。他們通過高通量測序開展了體細(xì)胞超突變分析，并在多種底物上開展脫氨分析。他們還通過分子動力學(xué)模擬和多種生化分析來研究AID與不同底物的相互作用。

技術(shù)路線

01

建立體外檢測抗體基因突變的新體系，發(fā)現(xiàn)AID酶活反應(yīng)重現(xiàn)小鼠抗體基因突變模式

02

通過抗體基因序列的隨機(jī)置換，發(fā)現(xiàn)周圍序列背景決定WRC基序的突變程度

03

通過分子動力學(xué)模擬和多種生化分析，發(fā)現(xiàn)DNA柔性有助于CDR區(qū)域發(fā)生超突變

04

柔性序列的引入可將突變“冷區(qū)”轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔儭盁釁^(qū)”

研究結(jié)果

1

AID活性和DNA序列本身決定了CDR超突變性

胞苷脫氨酶AID是一種僅含198個氨基酸的蛋白質(zhì)。體外分析表明，AID作用于單鏈DNA底物，且偏好作用于WRC（W=A/T，R=A/G）基序。然而，脫氨酶基序并不能解釋體細(xì)胞超突變的CDR偏好性，因為同樣的WRC基序也存在于抗體可變區(qū)內(nèi)的骨架區(qū)（FR），而且廣泛分布在基因組中。這些結(jié)果提示一些中尺度（5-50 bp）水平的元件可以增強(qiáng)特定WRC基序上的超突變。

研究人員從經(jīng)典的生化方法出發(fā)，聯(lián)合高通量測序技術(shù)，建立了體外檢測AID脫氨酶活性的新方法（圖1）。他們使用了一段124-nt的單鏈DNA底物，覆蓋小鼠VHB1-8外顯子中的FR3-CDR3序列，這段序列在體內(nèi)表現(xiàn)出WRC突變偏好。他們發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)CDR高突變特征可以在體外AID脫氨酶活分析中完全重現(xiàn)。

接下來，他們將生化分析的DNA底物擴(kuò)展到27種有頜脊椎動物的1084條抗體基因序列。他們發(fā)現(xiàn)，在使用體細(xì)胞超突變作為抗體多樣化策略的動物中，包括人、恒河猴、食蟹猴、小鼠、大鼠、狗、鴨嘴獸及羊駝等，CDR突變偏好高度保守。相比之下，一些采用基因轉(zhuǎn)換機(jī)制的物種，如雞、牛、羊和豬等，則并未表現(xiàn)出如此強(qiáng)烈的偏好。

2

周圍序列背景決定了WRC基序的突變性

那么，這種突變偏好是否受DNA序列背景的影響？為了檢驗這一點(diǎn)，研究人員構(gòu)建了一個攜帶IgVH-亂序等位基因的小鼠模型，其中每個CDR或FR的一個WRC（AGCT/AGCA）基序被保留在相同位置，而六個WRC基序周圍的序列被隨機(jī)置換。他們發(fā)現(xiàn)，在序列改變后突變頻率發(fā)生了顯著變化。這表明不同的DNA序列背景中可能存在中尺度的元件，增強(qiáng)或抑制WRC突變。

于是，他們利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了11種攜帶不同CDR3序列背景的小鼠模型。他們發(fā)現(xiàn)，其中6個模型的C/G核苷酸突變頻率降低，而1個模型的突變頻率升高。值得注意的是，序列改變越靠近WRC基序，則對該位點(diǎn)的突變頻率影響越大。這些結(jié)果表明，周圍序列背景決定了體內(nèi)WRC基序的突變程度。

為了繪制AID和單鏈DNA底物的潛在相互作用，研究人員在poly（dT）或poly（dA）的背景下對AID和AGCT底物進(jìn)行了分子動力學(xué)模擬。他們發(fā)現(xiàn)，在T底物中觀察到的相互作用在A底物中大大減弱，表現(xiàn)出一種截然不同的結(jié)合模式（圖2）。模擬出來的結(jié)合與AID在不同底物上的脫氨活性一致，因為在T底物上的活性高于A底物。因此，他們認(rèn)為AID與ssDNA骨架的靜電相互作用決定了脫氨的優(yōu)先順序，而ssDNA堿基序列可能會間接影響結(jié)合。

3

DNA柔性有助于CDR區(qū)域發(fā)生超突變

之后，他們探討了相關(guān)的物理特征，包括poly（dT）和poly（dA）在DNA柔性上的差異，其中poly（dT）最柔韌，而poly（dA）最僵硬。通過一系列分析，他們發(fā)現(xiàn)AID脫氨酶基序相鄰序列的柔性會影響AID脫氨酶的活性。中尺度DNA序列的柔性越大，越有利于結(jié)合AID表面的正電荷片區(qū)，進(jìn)而有助于突變的發(fā)生。單鏈DNA的柔性與嘧啶-嘧啶（Py-Py）二核苷酸的含量呈正相關(guān)。

通過分析抗體基因序列特征，研究人員發(fā)現(xiàn)CDR中的序列特征可能在密碼子或非編碼DNA水平上經(jīng)過了進(jìn)化選擇。他們發(fā)現(xiàn)CTA和ACT等基序（即TAC相關(guān)基序）在CDR中高度富集。他們將相關(guān)柔性序列插入抗體基因突變低頻區(qū)FR3中，構(gòu)建了序列改變的IgVH-FR3TAC乘客等位基因小鼠模型（該模型由賽業(yè)生物提供），發(fā)現(xiàn)柔性序列極大地提高了FR3區(qū)域的突變頻率，可將突變“冷區(qū)”轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔儭盁釁^(qū)”。

研究結(jié)論

總的來說，這項研究揭示了CDR區(qū)域發(fā)生高頻突變的分子機(jī)制（圖3），其中高密度的WRC基序和中尺度的DNA柔性都有助于CDR區(qū)域發(fā)生超突變。研究結(jié)果表明了抗體編碼序列在指導(dǎo)超突變中的非編碼作用，為設(shè)計下一代抗體基因人源化動物模型奠定了基礎(chǔ)。

原文檢索：

[1]Wang Y, Zhang S, Yang X, et al. Mesoscale DNA feature in antibody-coding sequence facilitates somatic hypermutation. Cell. 2023 May 11; 186(10): 2193-2207. e19. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.03.030