阿爾茨海默病

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease, AD）是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，常見于老年人，特別是65歲以上的人群。最初，阿爾茨海默病的癥狀可能是輕微的記憶問(wèn)題，例如難以記住最近發(fā)生的事件或容易迷失。隨著病情進(jìn)展，患者的記憶和思維能力受到了嚴(yán)重影響，可能會(huì)忘記熟悉的人和事物，變得困惑和易怒，甚至可能失去自理能力。阿爾茨海默病的治療難題在于我們尚未完全了解其發(fā)病機(jī)制。目前，普遍認(rèn)為的機(jī)制是，β淀粉樣蛋白的生成和清除失衡是導(dǎo)致神經(jīng)元變性和癡呆的始動(dòng)因素。異常水平的β淀粉樣蛋白在大腦神經(jīng)元之間形成斑塊，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元退化。研究阿爾茨海默病有助于我們深入了解該疾病的發(fā)生機(jī)制和診斷方法，進(jìn)而提供更為有效的治療方法和支持策略，從而提高患者的生活質(zhì)量。

2023年7月12日，福建醫(yī)科大學(xué)陳曉春教授課題組在《Molecular Neurodegeneration》（IF=15.1/Q1）雜志上發(fā)表了名為《ACSS2-dependent histone acetylation improves cognition in mouse model of Alzheimer’s disease》的研究論文。乙酰輔酶A池對(duì)組蛋白乙?；痍P(guān)鍵作用，而組蛋白乙?；瘎t控制著突觸的可塑性。突觸可塑性的損害是導(dǎo)致阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s Disease, AD）患者認(rèn)知損害的重要機(jī)制之一。該研究提示了ACSS2作為調(diào)節(jié)神經(jīng)元組蛋白乙?；拇x酶，是認(rèn)知障礙的關(guān)鍵分子開關(guān)，靶向ACSS2或給予乙酸鹽補(bǔ)充劑可能是治療中晚期AD的新策略。文中使用了來(lái)自漢恒生物的腺相關(guān)病毒AAV，對(duì)海馬ACSS2進(jìn)行了沉默，推動(dòng)了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展。

在這項(xiàng)研究中，通過(guò)檢測(cè)2、5和8月齡的5×FAD小鼠(阿爾茨海默病模型小鼠)海馬中組蛋白乙?；嚓P(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。但是，在8月齡時(shí)， ACSS2基因mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，作者檢測(cè)了10月齡的5×FAD小鼠海馬和腦前額葉中ACSS2蛋白的表達(dá)水平，并與同年齡段的野生型小鼠相比，發(fā)現(xiàn)5×FAD小鼠海馬和前額葉皮層中的ACSS2表達(dá)水平顯著降低(圖1A)。免疫熒光共染色結(jié)果還顯示，在5×FAD小鼠的CA1錐體神經(jīng)元中，ACSS2的表達(dá)明顯降低(圖1B)。此外，AD患者死后顳葉皮層中ACSS2蛋白水平也呈下降趨勢(shì)(圖1C)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，5×FAD小鼠海馬細(xì)胞核中的ACSS2明顯減弱(圖1D)。由于ACSS2可催化乙酸鹽生成乙酰輔酶A，接下來(lái)，研究人員檢測(cè)了海馬中乙酰輔酶A的水平，并發(fā)現(xiàn)10月齡的5×FAD小鼠的全細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中乙酰輔酶A的水平均顯著低于同年齡段的的野生型小鼠(圖1E)。由于乙酰輔酶A對(duì)組蛋白乙酰化和神經(jīng)元基因表達(dá)密切相關(guān)，作者對(duì)5×FAD小鼠海馬中與空間學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的組蛋白乙酰化(ac-H3K9、ac-H3K27和ac-H4K12)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，10月齡的5×FAD小鼠中ac-H3K9和ac-H4K12水平降低(圖1F-G)。綜上所述，在5×FAD小鼠中，ACSS2的降低伴隨著乙酰輔酶A和組蛋白乙?；降南抡{(diào)。

圖1? 5×FAD小鼠和AD患者認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)中ACSS2的表達(dá)

作者進(jìn)一步檢測(cè)了衰老過(guò)程中海馬ACSS2表達(dá)水平，8月齡的5×FAD小鼠中ACSS2蛋白水平顯著降低，而10月齡時(shí)這種趨勢(shì)更為明顯(圖2A)。為了評(píng)估8月齡的5×FAD小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，采用了Morris水迷宮（MWM）測(cè)試。結(jié)果顯示，在訓(xùn)練期（1-5天）和實(shí)驗(yàn)期（第6天），與同年齡段的野生型小鼠相比，8月齡的5×FAD小鼠表現(xiàn)出更長(zhǎng)的逃避潛伏期（指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每次入水后第一次成功找到站臺(tái)所需的時(shí)間）(圖2 B)。此外，在測(cè)試期間，5×FAD小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)減少（指在撤去站臺(tái)后，在一定的時(shí)間內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穿越原站臺(tái)位置的次數(shù)），在目標(biāo)象限的時(shí)間也減少（在站臺(tái)所在象限活動(dòng)的時(shí)間越長(zhǎng)，反映了動(dòng)物的空間記憶能力比較好）(圖2 C-D)。進(jìn)一步的分析表明，ACSS2蛋白水平與在目標(biāo)象限的時(shí)間和穿越平臺(tái)的次數(shù)呈正相關(guān)(圖2F)。

圖2 下調(diào)ACSS2與5×FAD小鼠的認(rèn)知損害相關(guān)

為了驗(yàn)證ACSS2對(duì)5×FAD小鼠認(rèn)知的影響，作者通過(guò)在小鼠背側(cè)海馬注射過(guò)表達(dá)ACSS2的腺相關(guān)病毒來(lái)彌補(bǔ)這種表達(dá)的衰弱(圖3A)。Western Blot和免疫熒光分析結(jié)果顯示，無(wú)論是5×FAD小鼠還是野生型小鼠，ACSS2的表達(dá)均顯著上調(diào)(圖3B-C)。與FAD-GFP小鼠相比，F(xiàn)AD-ACSS2小鼠在訓(xùn)練期（1-5天）和實(shí)驗(yàn)期（第6天）表現(xiàn)出更短的逃避潛伏期(圖3D)。同樣，在測(cè)試期間，上調(diào)ACSS2顯著增加了穿越平臺(tái)次數(shù)（圖3E）和在目標(biāo)象限的時(shí)間（圖3F），但并未影響游泳速度（圖3G）。綜上所述，這些結(jié)果表明，上調(diào)ACSS2可以在一定程度上減輕5×FAD小鼠的認(rèn)知功能障礙。

圖3 上調(diào)ACSS2改善了5×FAD小鼠的認(rèn)知表現(xiàn)

為了評(píng)估上調(diào)ACSS2對(duì)5×FAD小鼠海馬整體信號(hào)通路的影響，作者進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，差異表達(dá)基因(DEGs)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR<0.05和|fold change|≥1.2。在FAD-GFP小鼠與WT-GFP小鼠之間，有824個(gè)差異基因(635個(gè)上調(diào)基因和189個(gè)下調(diào)基因)；而在FAD-ACSS2小鼠與FAD-GFP小鼠之間，有824個(gè)差異基因(548個(gè)上調(diào)基因和274個(gè)下調(diào)基因)（圖4A）。進(jìn)一步的KEGG富集分析顯示，突觸可塑性相關(guān)的信號(hào)通路（如谷氨酸能突觸、軸突導(dǎo)向等）在FAD-GFP小鼠中顯著改變 (圖4C)。作者進(jìn)行了加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)，鑒定出34個(gè)模塊，其中Brown模塊與FAD-ACSS2小鼠呈正相關(guān)（0.94），并與“谷氨酸能突觸”、“神經(jīng)元之間突觸”、“不對(duì)稱突觸”、“突觸后密度”和“突觸后特化”等通路密切相關(guān)(圖4E)。綜上所述，上調(diào)ACSS2促進(jìn)了5×FAD小鼠中與突觸可塑性相關(guān)的信號(hào)通路。

圖4? FAD-ACSS2小鼠的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

根據(jù)之前的研究，NMDA受體和AMPA受體對(duì)突觸效能的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）和抑制（LTD）至關(guān)重要。在這里，作者使用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了小鼠海馬中NMDA受體亞基（Grin1/2a/2b）和AMPA受體亞基（Gria1/2/3）的mRNA水平，與FAD-GFP小鼠相比，F(xiàn)AD-ACSS2小鼠顯示了較高的谷氨酸受體mRNA水平(圖5A)。Western Blot結(jié)果也顯示FAD-ACSS2小鼠谷氨酸受體蛋白水平升高。通過(guò)ChIP-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD-ACSS2小鼠Grin1及Gria1等基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙酰化（acH3K9和acH4K12）水平呈上升趨勢(shì)，但各組間乙酰輔酶A水平無(wú)差異(圖5B-D)。作者對(duì)WT-GFP、FAD-GFP和FAD-ACSS2小鼠CA1錐體神經(jīng)元進(jìn)行了全細(xì)胞記錄，各組間mIPSC頻率和幅度均無(wú)差異(圖5E)，但上調(diào)ACSS2明顯增加了mEPSC振幅(圖5F)。進(jìn)一步對(duì)CA1區(qū)進(jìn)行LTP記錄，發(fā)現(xiàn)5×FAD小鼠的場(chǎng)興奮性突觸后電位(fEPSC)明顯受損，而上調(diào)ACSS2可以改善這種情況(圖5G)。綜上所述，上調(diào)ACSS2通過(guò)組蛋白乙?；緩秸{(diào)節(jié)了NMDA受體和AMPA受體的表達(dá)，增強(qiáng)了突觸的可塑性。

圖5 上調(diào)ACSS2通過(guò)組蛋白乙?；閷?dǎo)谷氨酸受體表達(dá)

為了驗(yàn)證補(bǔ)充ACSS2底物（乙酸鹽）是否具有類似的抗AD作用，作者對(duì)8月齡的5×FAD小鼠和野生型小鼠進(jìn)行了為期1個(gè)月的GTA（三乙酸甘油酯）灌胃補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)（2g/kg/d）。與FAD-Veh小鼠相比，F(xiàn)AD-GTA小鼠組蛋白乙?；╝c-H3K9/H3和ac-H4K12/H4）水平顯著升高(圖6A)。然而，ACSS2蛋白水平并無(wú)明顯差異(圖6A)。與上調(diào)ACSS2不同的是，補(bǔ)充GTA顯著增加了小鼠海馬中乙酰輔酶A（CoA）的含量（圖6B）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD-GTA小鼠顯示出較高水平的NMDA受體亞基（Grin2a）和AMPA受體亞基（Gria1/2/3）的mRNA水平，而NMDA受體亞基（Grin1/2b）的mRNA水平差異不明顯(圖6C)。同時(shí)，Western Blot結(jié)果也顯示類似差異(圖6D)。通過(guò)ChIP-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，與FAD-Veh小鼠相比，F(xiàn)AD-GTA小鼠Grin1及Gria1等基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙酰化（acH3K9和acH4K12）水平增加(圖6E)。進(jìn)一步的電生理顯示補(bǔ)充乙酸鹽顯著提高了5×FAD小鼠的LTP(圖6F)。最后，在水迷宮測(cè)試中，與FAD-Veh小鼠相比，F(xiàn)AD-GTA小鼠達(dá)到平臺(tái)的時(shí)間更短，穿越平臺(tái)次數(shù)和在目標(biāo)象限的時(shí)間也更多(圖6G-J)。綜上所述，補(bǔ)充ACSS2底物可以通過(guò)增加組蛋白乙酰化水平來(lái)上調(diào)谷氨酸受體的表達(dá)，最終改善5×FAD小鼠的認(rèn)知功能。

圖6 乙酸鹽補(bǔ)充劑通過(guò)組蛋白乙?；閷?dǎo)谷氨酸受體表達(dá)

為了探索ACSS2在乙酸鹽介導(dǎo)的5×FAD小鼠認(rèn)知保護(hù)中的作用，研究者將攜帶shACSS2的腺相關(guān)病毒（漢恒生物）注射到7月齡的5×FAD小鼠背側(cè)海馬，以減少ACSS2的表達(dá)。小鼠接受病毒感染一個(gè)月后，進(jìn)行為期4周的GTA（2g/kg/d）治療（圖7A）。與FAD-GFP-GTA小鼠相比，F(xiàn)AD-shACSS2-GTA小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中顯示出更長(zhǎng)的逃避潛伏期，在目標(biāo)象限內(nèi)的時(shí)間較短（圖7B-E）。此外，ACSS2基因沉默抑制了GTA引起的乙酰輔酶A含量的增加，并抑制了GTA治療引起的組蛋白乙?；缴险{(diào)（圖7F-G）。最后，ACSS2基因沉默還抑制了GTA介導(dǎo)的NMDA受體和AMPA受體表達(dá)的促進(jìn)作用（圖7H和I）。這些結(jié)果表明，在5×FAD小鼠中，GTA補(bǔ)充通過(guò)組蛋白乙?；{(diào)節(jié)谷氨酸受體表達(dá)，增強(qiáng)突觸可塑性和認(rèn)知功能，而ACSS2基因沉默可以阻礙這種效應(yīng)（圖7J）。

圖7 通過(guò)沉默ACSS2基因，抑制乙酸鹽誘導(dǎo)的谷氨酸受體上調(diào)

綜上，該研究闡明了ACSS2在AD中的作用機(jī)制：ACSS2通過(guò)產(chǎn)生乙酰輔酶A促進(jìn)谷氨酸受體的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)突觸的可塑性，最終改善小鼠的認(rèn)知能力；下調(diào)ACSS2則通過(guò)組蛋白乙?；档蛯?dǎo)致谷氨酸受體表達(dá)減少，進(jìn)一步損害了突觸的可塑性。有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)在ACSS2水平降低的5×FAD小鼠中，乙酸鹽給予產(chǎn)生了與ACSS2相似的效果。這表明，該物質(zhì)具有作為藥物的潛力。