蛋白質(zhì)磷酸化(Protein phosphorylation)是生物界最普遍也是最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Post-translational modifications, PTMs)。20世紀(jì)50年代以來(lái)一直被生物學(xué)家看作是一種動(dòng)態(tài)的生物調(diào)節(jié)過(guò)程，在細(xì)胞中，大約有1/3的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是經(jīng)過(guò)磷酸化修飾的。在人類基因組中大約有2%的基因編碼了500種激酶和100種磷酸酶。蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化是原核和真核生物細(xì)胞表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)對(duì)許多生物的細(xì)胞功能起開(kāi)關(guān)調(diào)控作用是種普遍的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，因此蛋白質(zhì)磷酸化的分析和磷酸化位點(diǎn)的鑒定已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的焦點(diǎn)之一。

蛋白質(zhì)磷酸化的主要類型與功能

磷酸化蛋白質(zhì)根據(jù)其磷酸氨基酸殘基的不同大致可分為四類，即：O-磷酸鹽，N-磷酸鹽，酰基磷酸鹽和S-磷酸鹽。O-磷酸鹽是通過(guò)羥氨基酸的磷酸化形成的，如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸，羥脯氨酸或羥賴氨酸的磷酸化仍不清楚；N-磷酸鹽是通過(guò)精氨酸、賴氨酸或組氨酸的磷酸化形成的；?；姿猁}是通過(guò)天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成；而S-磷酸鹽通過(guò)半胱氨酸磷酸化形成。

蛋白質(zhì)磷酸化具有以下功能：(1)磷酸化參與酶作用機(jī)制，在此過(guò)程磷酸化為反應(yīng)性中間產(chǎn)物(多為S-或N-磷酸鹽)，如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依賴的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PIR)的組氨酸蛋白激酶(HPr)；(2)磷酸化介導(dǎo)蛋白活性，蛋白分子通過(guò)蛋白激酶發(fā)生磷酸化，如蛋白激酶A(絲氨酸和蘇氨酸殘基)或不同的受體酪氨酸酶(酪氨酸殘基)；(3)天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸的磷酸化在細(xì)菌趨化反應(yīng)的感覺(jué)性傳導(dǎo)中發(fā)生解離。

常用的蛋白質(zhì)磷酸化的檢測(cè)方法

1 Western blot蛋白免疫印跡

蛋白質(zhì)磷酸化作用可以通過(guò)Western blot利用抗磷酸化蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)。WB特異性好、分辨率高，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，以一抗為探針，結(jié)合標(biāo)記的二抗并以自顯影或者底物顯色來(lái)顯示蛋白條帶。凝膠由上層的濃縮膠和下層的分離膠組成。蛋白樣品經(jīng)過(guò)濃縮膠和分離膠后會(huì)以清晰的印跡按分子量大小依次上下排列于膠面上，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)或NC膜(硝移纖維素膜)，蛋白會(huì)以非共價(jià)鍵的形式穩(wěn)固地結(jié)合在載體上，選擇對(duì)應(yīng)的磷酸化抗體，發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，再與酌或同位素標(biāo)記的二抗起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性磷酸化蛋白成分。但細(xì)胞中的磷酸化信號(hào)通常比較弱，需要經(jīng)過(guò)磷酸化富集后 Western blot 才能檢驗(yàn)到。

基于SingleB?快速單抗平臺(tái)，德泰生物提供磷酸化鼠單克隆抗體制備服務(wù)和磷酸化兔單克隆抗體制備服務(wù)。德泰生物的專業(yè)抗體研發(fā)團(tuán)隊(duì)在設(shè)計(jì)免疫原、合成磷酸化多肽及磷酸化抗體篩選、制備技術(shù)上具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，最終交付的抗體將通過(guò)磷酸化多肽與非磷酸化多肽的交叉驗(yàn)證，確保符合交付標(biāo)準(zhǔn)。

2 32P同位素放射性標(biāo)記法

蛋白質(zhì)磷酸化可以通過(guò)識(shí)別電泳凝膠上的同位素蛋白點(diǎn)來(lái)檢測(cè)。用32P同位素放射性標(biāo)記法，即體內(nèi)代謝培養(yǎng)用32P同位素放射性標(biāo)記磷酸鹽作為磷酸基團(tuán)供體，經(jīng)過(guò)磷酸化酶促反應(yīng)，帶有32P同位素放射性標(biāo)記的磷酸基團(tuán)則轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的反應(yīng)蛋白上，通過(guò)凝膠電泳分離，可以用放射自顯影或磷儲(chǔ)屏檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)。但放射性標(biāo)記只能在細(xì)胞中應(yīng)用，比較局限目有放射性危險(xiǎn)。

3 熒光染色法

可通過(guò)熒光染色試劑檢測(cè)磷酸化位點(diǎn)中的酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸的磷酸化，主要用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中蛋白磷酸化的研究，可以直接用來(lái)染色磷酸化蛋白凝膠，同時(shí)可與質(zhì)譜兼容，不妨礙隨后蛋白質(zhì)組中多種磷酸化分析研究。熒光染色試劑對(duì)高豐度且磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化速率低的蛋白質(zhì)具有較高的靈敏度，但對(duì)于不同的磷酸化位點(diǎn)，靈敏度差異較大。

4 流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)采用熒光標(biāo)記的單細(xì)胞懸液為檢測(cè)樣品，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記熒光的熒光強(qiáng)度來(lái)確定所檢測(cè)細(xì)胞或細(xì)胞因子的濃度。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)熒光標(biāo)記的磷酸化蛋白質(zhì)特異性抗體可以精確測(cè)量單細(xì)胞內(nèi)的多參數(shù)磷酸化，可以同時(shí)在不同的細(xì)胞亞群中分析幾種信號(hào)通路組成元件，大大提高了工作效率。研究人員可以根據(jù)需要分別檢測(cè)各細(xì)胞亞群的磷酸化水平，從多層次探索信號(hào)轉(zhuǎn)到機(jī)制，且可以同時(shí)分析多種參數(shù)之間的相互關(guān)系。但流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)需要特異性熒光染料，耗費(fèi)高、儀器貴。

5 質(zhì)譜分析法

運(yùn)用質(zhì)譜可以測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目及其位置，是一種可發(fā)現(xiàn)和鑒別翻譯后修飾的方法?；谫|(zhì)譜的蛋白磷酸化分析包括：1.識(shí)別磷酸化多肽的存在；2.根據(jù)氨基酸序列確定磷酸化類型；3.確定磷酸化位點(diǎn)；4.定量確定蛋白磷酸化位點(diǎn)。蛋白磷酸化理論上都可以運(yùn)用質(zhì)譜檢測(cè)，但質(zhì)譜分析酶解磷酸化蛋白并不能檢測(cè)全部蛋白序列，可能會(huì)有重要磷酸化區(qū)域被忽略，且細(xì)胞中磷酸化蛋白含量甚微，磷酸化肽段的信號(hào)容易被非磷酸化肽段的信號(hào)所抑制，所以有必要在質(zhì)譜分析之前進(jìn)行磷酸化蛋白和肽段的富集。