雜交瘤技術(shù)又稱為單克隆抗體技術(shù)（monoclonal antibody technique），顧名思義其主要用于制備單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞系的建立主要由三個(gè)關(guān)鍵步驟組成，分別為動(dòng)物免疫，細(xì)胞融合，雜交瘤篩選。

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　　雜交瘤細(xì)胞是具有分泌特異性抗體的B淋巴細(xì)胞與具有增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合，通過(guò)無(wú)性繁殖形成的細(xì)胞系。因此首先需要獲得兩個(gè)親本細(xì)胞，這是建立雜交瘤細(xì)胞系的前提。

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　　動(dòng)物免疫獲得免疫B淋巴細(xì)胞

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　　要獲得能夠分泌特異性抗體的B淋巴細(xì)胞就需要用抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。

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　　抗原：制備抗體的抗原在種類上幾乎沒(méi)有限制，具有抗原性質(zhì)的物質(zhì)都可以制備單克隆抗體。在免疫動(dòng)物的過(guò)程中，我們常常將抗原分為2種類型：可溶性抗原如蛋白質(zhì)，核酸等；顆粒性抗原如病毒，細(xì)菌，細(xì)胞等。一般顆粒性抗原都具有較強(qiáng)的免疫原性，可以不加佐劑，而可溶性蛋白抗原在免疫時(shí)需要添加佐劑，以獲得良好的免疫效果。

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　　動(dòng)物免疫

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　?。?）動(dòng)物的選擇目前常用的免疫動(dòng)物為來(lái)自BALB/c小鼠和Lou大鼠以制備小鼠單克隆抗體和大鼠單克隆抗體。

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　?。?）免疫方法：常用的免疫方法有以下三種

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　　體內(nèi)免疫法：通常指皮下，肌肉及腹腔免疫，多適用于各種顆粒性抗原和可溶性抗原。一般顆粒性抗原細(xì)胞的用量為2×107，且不需要加佐劑；可溶性抗原用量一般情況下不超過(guò)100μL，并需要加適宜的免疫佐劑。

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　　體外免疫法：從脾臟或者外周血分離B淋巴細(xì)胞在體外與抗原共同培養(yǎng)。此方法多用于制備單克隆抗體，如乙肝疫苗基礎(chǔ)免疫后，取人外周血分離B淋巴細(xì)胞與乙肝表面抗原共同培養(yǎng)，制備人抗乙肝單抗。

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　　脾內(nèi)免疫法：借助外科手術(shù)暴露動(dòng)物的脾臟，將抗原直接注入脾臟。此方法一般需抗原量少，適用于一些來(lái)源有限且昂貴的抗原免疫。

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　　（3）免疫過(guò)程：

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　　可溶性抗原加佐劑后，皮下多點(diǎn)注射，至少三點(diǎn)以上，基礎(chǔ)免疫一般4-6周，同劑量抗原加強(qiáng)免疫后，于融合前3-4天，靜脈加強(qiáng)。

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　　顆粒性抗原基礎(chǔ)免疫2-3周，間隔一周加強(qiáng)免疫，2-3次，于融合前3-4天用相應(yīng)抗原靜脈加強(qiáng)后取脾B淋巴細(xì)胞用于融合。

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　　骨髓瘤細(xì)胞的選擇

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　　要取得良好的細(xì)胞融合效果，所用的雜交瘤細(xì)胞必須處于良好的生理狀態(tài)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瘤細(xì)胞最佳。細(xì)胞數(shù)低于104/mL時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，一般在104-5×105/mL時(shí)呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞渾圓透亮，大小均一，排列整齊。當(dāng)細(xì)胞密度超過(guò)106/mL以上時(shí)，細(xì)胞停止分裂，細(xì)胞發(fā)暗，皺縮。因此一般細(xì)胞傳代選擇(1-5)×105/mL的濃度，且融合時(shí)活細(xì)胞數(shù)至少應(yīng)該大于90%。

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　　一株好的骨髓瘤細(xì)胞株應(yīng)該具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：1）穩(wěn)定，易培養(yǎng)；2）自身不分泌免疫球蛋白；3）融合率高；4）屬于HGPRT缺陷株，便于HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞。

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　　常見(jiàn)的骨髓瘤親本細(xì)胞

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　　細(xì)胞融合

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　　在獲得兩個(gè)親本細(xì)胞以后需要對(duì)其融合，以獲得B淋巴細(xì)胞-骨髓瘤細(xì)胞雜合體。細(xì)胞融合是指在自然或者人工條件下使得兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞合并為一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。雖然細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可能會(huì)自發(fā)融合，但是概率極低，因此需要借助外界誘導(dǎo)方法促進(jìn)細(xì)胞融合。

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　　誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有生物法，化學(xué)法和物理法。

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　　生物法：如紫外滅火的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合，其可以大大提高融合概率，在病毒類融合劑中最為有效，適用廣泛。

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　　化學(xué)法：目前應(yīng)用廣泛的有聚乙二醇。其易得，簡(jiǎn)便，融合效果也穩(wěn)定。

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　　物理法：電融合

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　　雜交瘤細(xì)胞篩選

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　　1）雜交瘤細(xì)胞選擇

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　　細(xì)胞融合會(huì)產(chǎn)生三種融合細(xì)胞：B淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合體，骨髓瘤與骨髓瘤細(xì)胞融合體，第三種就是需要篩選出來(lái)的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤的雜合體。

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　　采用HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，在該培養(yǎng)基中只有骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞的雜合體才能存活并無(wú)限增殖。為此，在接種96孔板培養(yǎng)時(shí)，加入一定量的HAT培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)1-2周的培養(yǎng)，雜交瘤細(xì)胞被選擇培養(yǎng)出來(lái)。

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　　2）特異性抗體篩選

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　　初步篩選出來(lái)的雜交瘤細(xì)胞并不一定都能分泌特異性抗體，因此還需要進(jìn)一步對(duì)這些雜合體進(jìn)行篩選。目前實(shí)驗(yàn)室常用的是酶聯(lián)免疫法，也就是將抗原固相在微孔板上，細(xì)胞培養(yǎng)上清一定時(shí)間后，用酶標(biāo)記的抗鼠二抗，通過(guò)酶促底物的顏色變化了解是否存在針對(duì)該抗原的特異性抗體。該方法簡(jiǎn)便易行且可大規(guī)模操作，所以目前實(shí)驗(yàn)室都廣泛采用此方法。

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　　雜交瘤細(xì)胞克隆建株

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　　在細(xì)胞融合初期，雜交瘤細(xì)胞的染色體常有丟失的現(xiàn)象，甚至導(dǎo)致其喪失分泌特異性抗體的功能。因此，在篩選抗體陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞時(shí)，應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，以保持雜交瘤細(xì)胞具有同源的子代。常見(jiàn)的方法有很多，比如有限稀釋法（limiting dilution method）、軟瓊脂法（soft agar method）、單細(xì)胞顯微操作法（single cell micromanipulation method）和熒光激活細(xì)胞分類儀（fluorescence activated cell sorter）。

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　　雜交瘤細(xì)胞一經(jīng)建立應(yīng)盡快凍存，保證雜交瘤細(xì)胞不會(huì)被污染或變異。因此，必須在得到分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞后的早期，保存幾批細(xì)胞于液氮中，以便在發(fā)生意外時(shí)可以將其復(fù)蘇，繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。