CRISPR/Cas9技術(shù)可以讓目的基因產(chǎn)生功能性缺失突變，并由此改變了科學(xué)家研究目的基因的方式。利用CRISPR/Cas9技術(shù)在單個(gè)細(xì)胞上產(chǎn)生一個(gè)突變來建立一個(gè)新的細(xì)胞系，也就是CRISPR介導(dǎo)的基因敲除克隆。這些克隆細(xì)胞系是探索蛋白質(zhì)功能、分析敲除基因后的結(jié)果和研究生物試劑特異性的重要工具。然而，想要成功獲取到敲除克隆，在技術(shù)上是具有一定挑戰(zhàn)性的。在實(shí)踐中，做一個(gè)基因敲除克隆并不是那么簡單的。想要獲得高質(zhì)量和可復(fù)制的編輯細(xì)胞可能需要一定的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)優(yōu)化。

CRISPR基因敲除細(xì)胞株的標(biāo)準(zhǔn)工作流程，涵蓋從項(xiàng)目設(shè)計(jì)方案到單克隆驗(yàn)證的五個(gè)主要步驟：

1、設(shè)計(jì)基因敲除方案并制備敲除載體

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

3、KO細(xì)胞的擴(kuò)增

4、挑單克隆細(xì)胞并擴(kuò)增

5、KO驗(yàn)證

可想而知這個(gè)過程中會涉及到許多不同實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，因此上述的每一步都是需要你仔細(xì)考慮并且對你的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)與技術(shù)操作都有較高的要求，你做好全面地學(xué)習(xí)構(gòu)建KO細(xì)胞系的準(zhǔn)備了嗎？

如何設(shè)計(jì)和構(gòu)建gRNA：

gRNA可以識別靶基因區(qū)域并將Cas9引導(dǎo)至DNA的靶部分。對于gRNA的制作，需要設(shè)計(jì)和合成gRNA寡核苷酸序列。然后將合成的寡核苷酸克隆到合適的表達(dá)載體中并驗(yàn)證寡核苷酸序列。

研究人員可以用幾種不同的形式去構(gòu)建敲除細(xì)胞株，如單gRNA，雙oligo系統(tǒng)的cr:tracrRNA，體外轉(zhuǎn)錄 RNA，質(zhì)粒和慢病毒。其中，基于質(zhì)粒和慢病毒的方法是最受研究人員歡迎的。但是它們耗時(shí)、需要進(jìn)行篩選，并且有可能導(dǎo)致脫靶。但慢病毒對一些難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有著顯著優(yōu)勢。此外，使用多個(gè)gRNA可以增加編輯成功的幾率，并在挑克隆階段節(jié)省下游時(shí)間。但前提是這些gRNA必須是要正確靶向靶位點(diǎn)的。構(gòu)建敲除細(xì)胞株，首先要設(shè)計(jì)靶向目的基因的gRNA，gRNA需要克隆到合適的表達(dá)載體中并進(jìn)行g(shù)RNA的序列驗(yàn)證。

事實(shí)上，設(shè)計(jì)gRNA需要考慮的因素比較多，對于操作者的專業(yè)能力與實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)都有較高的要求，如果你對自己設(shè)計(jì)的gRNA沒有足夠的信息，可以考慮使用一些gRNA設(shè)計(jì)工具，比如紅棉系統(tǒng)-CRISPR基因編輯設(shè)計(jì)工具，它是可用于在線設(shè)計(jì)敲除細(xì)胞株方案和gRNA的免費(fèi)工具。其中包含了800多個(gè)細(xì)胞系的參數(shù)，并結(jié)合了源井生物領(lǐng)先的gRNA設(shè)計(jì)原理。您只需要輸入目的基因，就可以得到3種不同的敲除方案。同時(shí)，紅棉系統(tǒng)有一個(gè)gRNA載體庫，其中有在實(shí)驗(yàn)中被成功驗(yàn)證過的gRNA，其中超過10000個(gè)用于構(gòu)建敲除細(xì)胞株的gRNA載體，低至388元，如果你需要找到一個(gè)合適的gRN

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：

確定了CRISPR敲除方案之后，下一步就是選擇最有效的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法。許多研究人員認(rèn)為選出最有效的轉(zhuǎn)染方法是CRISPR工作流程中最困難的一步。每種細(xì)胞類型通常需要不斷優(yōu)化，調(diào)整轉(zhuǎn)染條件以準(zhǔn)確地將CRISPR基因編輯載體遞送到細(xì)胞中。除此之外，一些細(xì)胞類型，包括干細(xì)胞，原代細(xì)胞和免疫和造血細(xì)胞譜系更難以轉(zhuǎn)染，因?yàn)樗鼈兏淖兞思?xì)胞修復(fù)機(jī)制，降低了細(xì)胞活力。因此，想要成功轉(zhuǎn)染的前提就是對目的細(xì)胞系的經(jīng)驗(yàn)以了解細(xì)胞特征。

源井生物已經(jīng)成功編輯超過100種細(xì)胞系，并開發(fā)了一個(gè)成熟的操作體系來探索針對不同細(xì)胞系的最佳轉(zhuǎn)染方法，我們領(lǐng)先的技術(shù)以及豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)讓我們的KO細(xì)胞服務(wù)值得每一位研究工作者給予信賴！

挑單克隆和細(xì)胞擴(kuò)增：

挑單克隆被認(rèn)為是選取一個(gè)勻質(zhì)、單一的含有所需基因敲除的細(xì)胞團(tuán)的最佳方法。研究人員通常使用兩種常用的挑單克隆和擴(kuò)增方法，一種是用極限稀釋法來挑單克隆，另一種是單細(xì)胞熒光激活細(xì)胞分選（fluorescence-activated cell sorting, FACS）。盡管兩種方法都可以達(dá)到挑單克隆和擴(kuò)增的目的，鑒于FACS分選得特異性分離雙陽性細(xì)胞的能力，F(xiàn)ACS通常更有效。然而，極限稀釋法比分選更便宜并且可能導(dǎo)致更少的細(xì)胞應(yīng)激。此外，在這個(gè)階段，研究人員應(yīng)該注意細(xì)胞要處于一個(gè)完全優(yōu)化的生長條件下生長，否則，它可能導(dǎo)致珍貴細(xì)胞樣本的死亡和產(chǎn)生敲除細(xì)胞系的所有工作都被白費(fèi)了。

對于一些細(xì)胞系來說，產(chǎn)生單細(xì)胞克隆是棘手的，只有少數(shù)克隆可能在分離過程中能茁壯成長。源井生物在克隆分離方面具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，我們會在預(yù)實(shí)驗(yàn)階段找出產(chǎn)生單細(xì)胞克隆的最佳方法。

驗(yàn)證：

當(dāng)構(gòu)建好敲除細(xì)胞系之后，就需要對特定基因編輯進(jìn)行充分驗(yàn)證，這是KO實(shí)驗(yàn)的最后一步了，也是最令人期待的一步。驗(yàn)證細(xì)胞KO是否成功需要對敲除細(xì)胞進(jìn)行表征并確保工作的下游可行性。有多種方法可以用來驗(yàn)證細(xì)胞系的基因是否有被正確編輯。驗(yàn)證工程細(xì)胞系的常用方法包括Sanger測序，新一代測序NGS和qPCR以在基因組水平上驗(yàn)證編輯。蛋白質(zhì)印跡WB和質(zhì)譜可以在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上確認(rèn)KO。對于功能研究，經(jīng)常使用免疫組織化學(xué)，免疫細(xì)胞化學(xué)和FACS。如果你在基因水平，蛋白質(zhì)水平和功能水平上都得到了預(yù)期的結(jié)果，那真的要好好恭喜你了！因?yàn)樵谝话闱闆r下，在蛋白質(zhì)水平上的驗(yàn)證往往不如人意，但是想發(fā)高分文章卻常常躲不掉這一步，因此能100%保障WB結(jié)果成功是來評價(jià)一個(gè)細(xì)胞敲除服務(wù)的關(guān)鍵指標(biāo)。

源井生物CRISPR-U?敲除細(xì)胞株

源井生物開發(fā)的CRISPR-U?系統(tǒng)可用于精確的基因組編輯，我們敲除細(xì)胞系通過使用qPCR，Sanger測序以及WB在許多情況下均通過了驗(yàn)證，目前已經(jīng)有超過5000個(gè)基因確認(rèn)在基因組和蛋白質(zhì)組水平上的成功敲除?，F(xiàn)在我們的KO細(xì)胞服務(wù)正在參與夏季大促，只需1.58萬元，即可享受100%保證WB的細(xì)胞敲除服務(wù)，夏不為利，厚惠有期，點(diǎn)擊即可了解更多優(yōu)惠詳情！