食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）是一種世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤，由于缺乏有效的生物標(biāo)志物，死亡率高，預(yù)后差。因此，探索可靠的預(yù)后標(biāo)志物來(lái)監(jiān)測(cè)ESCC患者的康復(fù)情況以進(jìn)行個(gè)性化治療是必要的。外泌體是由幾乎所有類型的活細(xì)胞分泌的直徑為30-150nm的細(xì)胞外囊泡。它們?cè)谡{(diào)節(jié)細(xì)胞通信、細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。大量研究表明，外泌體主要參與了癌癥的發(fā)生和進(jìn)展，并可用于癌癥的早期檢測(cè)、預(yù)后和治療指導(dǎo)。關(guān)于食管癌，有報(bào)道稱外泌體蛋白和RNA都是癌癥診斷的潛在生物標(biāo)志物。而關(guān)于外泌體代謝物作為食管癌診斷的生物標(biāo)志物卻鮮有報(bào)導(dǎo)。

Nanoscale期刊上發(fā)布的題為“Metabolomic analysis of exosomal-markers in esophageal squamous cell carcinoma”的研究結(jié)果，研究者通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)分析了復(fù)發(fā)患者和食管切除術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)患者的外泌體的代謝組模式，展示了一個(gè)預(yù)測(cè)ESCC復(fù)發(fā)的代謝標(biāo)志物panel，準(zhǔn)確率為98%。這些代謝組特征在所有ESCC階段都保持了很高的差異變化值，并且很可能與癌癥代謝相關(guān)，有可能作為ESCC診斷和預(yù)后的新的生物標(biāo)志物。

研究材料

91例臨床血漿樣本，包括34例復(fù)發(fā)性ESCC患者，37例非復(fù)發(fā)性ESCC患者和20例健康對(duì)照組

技術(shù)路線

步驟1：血漿外泌體分離及鑒定，用于后續(xù)組學(xué)分析；

步驟2：外泌體代謝組分析，獲得差異代謝物，用于后續(xù)biomarker篩選；

步驟3：隨機(jī)森林模型篩選生物標(biāo)志物panel，用于ESCC診斷及疾病監(jiān)測(cè)。

重要結(jié)果展示

1. ESCC患者血漿外泌體分離和鑒定

介導(dǎo)細(xì)胞間通信的外泌體很可能攜帶與ESCC相關(guān)的重要代謝物。在這項(xiàng)工作中，作者使用實(shí)驗(yàn)室最近開發(fā)的一種從血漿樣本中分離和純化外泌體的方法。然后對(duì)分離和純化的外泌體進(jìn)行鑒定，包括納米顆粒跟蹤分析（NTA）、western blot（WB）和透射電鏡（TEM）。

2. 外泌體代謝組分析

接下來(lái)，作者從外泌體中提取代謝物，并用靶向UPLC-MS/MS方法對(duì)這些化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。共檢測(cè)到196種代謝物，主要包括脂質(zhì)脂肪酸、苯及取代衍生物、氨基酸、有機(jī)酸、碳水化合物、脂肪酸?；?。在所有代謝物類別中，有機(jī)酸及其衍生物和脂質(zhì)脂肪酸是最豐富的代謝物類型，分別占16.41%和12.31%，脂質(zhì)組分也占2.56%（圖2a）。然后，基于差異代謝物和多變量統(tǒng)計(jì)分析，研究了三組間代謝組學(xué)模式的變化。正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）（圖2b），以最大限度地展示出健康對(duì)照組、復(fù)發(fā)組和非復(fù)發(fā)組患者的代謝組學(xué)分析的差異。隨后通過(guò)閾值VIP＞1，p<0.05篩選了各組的差異代謝物。圖2c展示了差異代謝物對(duì)應(yīng)豐度的聚類分析，各組間存在明顯的代謝組學(xué)模式變化。進(jìn)一步對(duì)健康對(duì)照組、復(fù)發(fā)組和非復(fù)發(fā)組間差異代謝物進(jìn)行venn分析，共觀察到12個(gè)共有差異代謝物。（圖2d）。

3. 基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選ESCC診斷和監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物

然后，作者探討了這些差異代謝物是否可以作為區(qū)分復(fù)發(fā)和非復(fù)發(fā)患者的標(biāo)志物。在VIP > 1、p < 0.05和FC的多重選擇條件下，得到11個(gè)下調(diào)代謝物和4個(gè)上調(diào)代謝物(FC > 1.2或FC<0.83。基于隨機(jī)森林模型進(jìn)一步研究了復(fù)發(fā)和非復(fù)發(fā)患者的生物標(biāo)志物。樣本隨機(jī)分為兩組，即訓(xùn)練組（25例復(fù)發(fā)患者和25例非復(fù)發(fā)患者）和測(cè)試組(9例復(fù)發(fā)患者和12例非復(fù)發(fā)患者）。在模型構(gòu)建中，使用森林中所有樹木的平均值作為預(yù)測(cè)重要性的衡量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)Gini指數(shù)（節(jié)點(diǎn)的純度）展示前50個(gè)候選標(biāo)記。

隨后，作者選擇了前4個(gè)代謝物（3‘-UMP、棕櫚烯酸、棕櫚醛、癸酸異丁酯）作為潛在的Biomarker panel，并研究其診斷效力。在主成分分析（PCA）中，該panel可以分離復(fù)發(fā)和非復(fù)發(fā)患者。ROC顯示了所選標(biāo)記面板的完美診斷性能，可以預(yù)測(cè)ESCC的復(fù)發(fā)，曲線下面積（AUC）為0.98。各代謝物在訓(xùn)練集中的診斷貢獻(xiàn)如圖所示，3’-UMP的診斷能力最高（AUC = 0.90），癸酸異丁酯為最弱的標(biāo)記物（AUC = 0.78）。除測(cè)試集中的棕櫚醛外，其他代謝物的豐度在復(fù)發(fā)組和非復(fù)發(fā)組之間均存在顯著差異。通過(guò)Kaplan-Meier（KM）分析進(jìn)一步評(píng)估這些指標(biāo)，也顯示出了良好的預(yù)測(cè)ESCC復(fù)發(fā)的潛力?？偟膩?lái)說(shuō)，作者研究了復(fù)發(fā)和非復(fù)發(fā)患者的外泌體代謝組變化。這些重要的代謝物可能與腫瘤代謝密切相關(guān)，并有可能用于ESCC的診斷和監(jiān)測(cè)。

結(jié)論

這項(xiàng)工作旨在描述ESCC復(fù)發(fā)患者和無(wú)復(fù)發(fā)患者對(duì)ESCC預(yù)后的外泌體代謝組學(xué)的變化模式。報(bào)道了一種基于血漿外泌體的代謝組標(biāo)記模式，使用隨機(jī)森林模型，可以預(yù)測(cè)ESCC的復(fù)發(fā)，AUC為98%。作者認(rèn)為，外泌體代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)中一個(gè)不斷發(fā)展的領(lǐng)域，在代謝組補(bǔ)體的全局和差異分析方面具有巨大的潛力，以揭示與細(xì)胞表型相關(guān)的直接差異。

中科新生命

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采用特異性外泌體高效富集方法Evtrap（Extracellular Vesicles Total Recovery And Purification），與傳統(tǒng)超離提取方法相比，Evtrap得率更高，特異性更強(qiáng)。

外泌體表征

透射電子顯微鏡（TEM）、納米顆粒追蹤分析（NTA）和免疫印跡等方法用于確定外泌體的數(shù)量和純度。

外泌體多組學(xué)產(chǎn)品

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