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研究背景

中藥療效確切、安全性高、副作用小，其多成分多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)已被廣泛接受。研究表明中藥原型入血成分和代謝產(chǎn)物均可能是有效活性成分，因此越來越多的中藥科研工作者展開了對中藥入血成分的分析研究。但據(jù)筆者了解，很多研究者并不清楚如何利用自己的研究數(shù)據(jù)去寫好相關(guān)的文章。為此，本期鹿明生物小編為大家整理了一篇：可以教大家寫好一篇中藥入血成分分析類型文章的完美案例推文，以供大家參考。

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前言

2022年08月，吉林延邊大學(xué)藥學(xué)院鄭教授課題組在“Food Research International”期刊（IF：7.452）發(fā)表的題為 “Comprehensive characterization of the chemical composition of Lurong

dabu decoction and its absorbed prototypes and metabolites in rat plasma using UHPLC–Q Exactive Orbitrap–HRMS”的研究成果，通過高靈敏度的UPLC-HRMS的研究方法來高分辨率和準(zhǔn)確地識別“鹿茸大補(bǔ)湯（LRDBD）”的物質(zhì)基礎(chǔ)，鑒定了122種成分，其中在血漿中鑒定出29種原型入血成分和35種代謝產(chǎn)物。為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶點(diǎn)和揭示LRDBD在哮喘治療中的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和方法。

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研究思路

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研究方法

研究材料

（1） 標(biāo)品：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，包括甜菜堿、鳥嘌呤、腺苷、（+）-兒茶素、苦杏仁苷、柚皮素和薯蕷皂苷，均購自成都普斯生物科技有限公司（中國四川）。DL-哌啶酸、L-（-）-蘋果酸、次黃嘌呤、尿苷、2′-脫氧核苷、異亮氨酸、（-）-epicatechin、d-酪氨酸、d-脯氨酸、d-組氨酸和甲酸鹽（純度≥98%）購自阿拉丁試劑有限公司（上海）；

（2） 生藥水提物：LRDBD水提物；8種單味草藥水提物；

（3） 血漿樣本：LRDBD給藥組（14只大鼠），生理鹽水組（8只）。

研究技術(shù)

（1） 采集/數(shù)據(jù)處理：UHPLC–Q Exactive Orbitrap–HRMS 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，QI軟件/CD軟件；

（2） 數(shù)據(jù)分析：PCA、火山圖；

（3）數(shù)據(jù)庫：mzCloudTM、mzVault、TCM、TCMSP、TCMIP數(shù)據(jù)庫匹配。

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研究結(jié)果

1、在LRDBD中主要成分鑒定122種

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LRDBD的含量采用高分辨率質(zhì)譜法進(jìn)行分析，對每個峰對應(yīng)的化合物進(jìn)行了初步鑒定。具體的鑒定步驟如下。首先，根據(jù)TCMSP和TCMIP建立8種單一草藥的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。然后，使用CD篩選平臺對MS數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，結(jié)合在線（mzCloud、mzVault），以匹配片段信息并識別化合物結(jié)構(gòu)。然后，根據(jù)準(zhǔn)一級精確質(zhì)量和二級碎片（匹配分?jǐn)?shù)大于85，誤差小于5.0 ppm）鑒定。圖1顯示了LRDBD在正離子和負(fù)離子模式下的UHPLC-MS基峰強(qiáng)度（BPI）色譜圖譜。

此外，利用HMDB數(shù)據(jù)庫和ChemDraw Pro對異構(gòu)體的分化進(jìn)行了補(bǔ)充?；谏鲜鲨b定策略，初步鑒定了LRDBD的122種化合物（詳細(xì)信息見表1），包括氨基酸、哌啶生物堿、季銨生物堿、有機(jī)胺生物堿、有機(jī)胺生物堿、苯丙類、嘌呤生物堿、黃酮、脂肪酸及其衍生物、香豆素、氰藻苷、茚生物堿、甾體、同異黃酮等。

圖1 通過UHPLC-HRMS分析得到的LRDBD的基峰強(qiáng)度（BPI）色譜圖

A: 正離子掃描，B：負(fù)離子掃描

表1利用UHPLC–Q Exactive Orbitrap–HRMS鑒定LRDBD的化學(xué)成分。

a通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較確定；b鹿角絨；c盾葉薯蕷；d苦艾；e麻黃；f杏仁仁；g麥冬；h蘆筍；i五味子的煎煮過程中產(chǎn)生的新成分

1.1對LRDBD中主要成分進(jìn)行來源歸屬

使用UHPLC–Q Exactive Orbitrap–HRMS對八種單一草藥煎劑進(jìn)行分析。然后LRDBD化合物的相對來源也得到了證實。8種單藥草在正、負(fù)離子模式下的BPI色譜圖見圖2。

圖2 ?用UHPLC-HRMS分析獲得的8種單一草藥的BPI色譜圖

1.2對LRDBD中主要成分進(jìn)行標(biāo)品比對確認(rèn)

根據(jù)保留時間、一級分子量的準(zhǔn)確測定，以及MS2片段（二級碎片）與標(biāo)準(zhǔn)品的比較結(jié)果，準(zhǔn)確鑒定了LRDBD中的17個化合物（見圖3）。

圖3 基于與參考標(biāo)準(zhǔn)品比較的化合物鑒定

1.3對LRDBD中122種化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)明確

為了明確所鑒定122種化合物的結(jié)構(gòu)，圖4展現(xiàn)了鑒定的化合物的主要結(jié)構(gòu)分類：圖4顯示了主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類。根據(jù)取代基的不同，鑒定出10種氨基酸、1種哌啶生物堿、2種季銨生物堿、6種有機(jī)胺生物堿、3種苯丙烷類、8種嘌呤生物堿、14種黃酮類化合物、17種脂肪酸化合物及其衍生物、3種香豆素類、2種氰基糖苷、2種吲哚生物堿、5種類固醇和2種同源異黃酮。

圖4在LRDBD中鑒定的主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)

另外，還鑒定出了其他43種化合物，如圖5所示。包括氨基酸、生物堿、苯丙素、氰磷酸糖苷、黃酮類化合物、脂肪酸及其衍生物。

圖5 在LRDBD中鑒定出的其他化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2、對LRDBD中不同成分類型的化合物鑒定過程進(jìn)行推導(dǎo)

通過對CD數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)的比較，對LRDBD中氨基酸、生物堿類、苯丙素類、糖苷類、黃酮類、脂肪酸及其衍生物、及其他化學(xué)成分類型的鑒定過程進(jìn)行推導(dǎo)說明。質(zhì)譜圖見圖6，具體推導(dǎo)鑒定過程如下：

2.1氨基酸

通過對CD數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)的比較，鑒定出了13個氨基酸。峰27在m/z 182.08127處有一個偽分子離子，在m/z136.07570（[M+H-COOH]+）和m/z119.04934（[M+H-COOH-NH3]+）處產(chǎn)生主要離子。在羧基的中性損失后，m/z 182處的碎片離子在m/z 136處產(chǎn)生了一個堿基峰，表明存在一個羧基。在羧基的中性損失后，m/z 182處的碎片離子在m/z 136處產(chǎn)生了一個堿基峰，表明存在一個羧基，因此，峰27被分配為d-酪氨酸（圖6-A）。

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圖6-A d-酪氨酸質(zhì)譜圖和化合物可能的破碎途徑

2.2 生物堿類

在LRDBD中鑒定出36種生物堿，包括哌啶生物堿、季銨鹽生物堿、有機(jī)胺生物堿、嘌呤生物堿和銦生物堿。通過與參考標(biāo)準(zhǔn)的比較，峰28被明確地指定為腺苷。腺苷的質(zhì)譜和可能的片段途徑如圖6-B所示。

圖6-B 腺苷質(zhì)譜圖和化合物可能的破碎途徑

其余類型化合物推導(dǎo)及圖見原文：doi: 10.1016/j.foodres.2022.111852.

3、LRDBD與單一草藥的多因素統(tǒng)計分析：復(fù)方中存在23種單一草藥中沒有的新化合物

在使用CD軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行比對和去卷積后，去除QC樣品中峰面積變化系數(shù)低于30%的背景離子和化合物，用于進(jìn)一步的PCA主成分和火山圖的多元分析。首先，PCA評分圖突出了QC樣品相對緊密的聚類，證實了樣品的色譜分離和質(zhì)譜分析在整個分析過程中都是穩(wěn)定的，數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性較好。然而，在LRDBD組和單藥草組的PCA評分圖中明顯分離（圖7-A）。

圖7-A ?從LRDBD和8種單一草藥中提取的正、負(fù)離子模式下的化合物的PCA評分圖

LRDBD和8種單一草藥的分析結(jié)果被總結(jié)在一個維恩圖中。如圖7-B所示，LRDBD湯劑中存在23種新成分。由于相容性、加熱等的影響，以及中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性，LRDBD在煎煮過程中由于溶液中化學(xué)成分的絡(luò)合、水解、氧化或還原反應(yīng)，可能產(chǎn)生新的成分。根據(jù)已知化合物，結(jié)合保留時間、m/z比和MS/MS片段信息，結(jié)合結(jié)構(gòu)推斷，從23種新成分中鑒定出9種成分：奎寧酸、原花青素A2、多聚素、氧白藜蘆醇、丙豆酸、18β-甘氨酸、2-羥丙基硬脂酸酯、單烯酸和化合物49。

圖7-B ?維恩圖顯示了在LRDBD和8種單一草本植物中鑒定出的和重疊的植物化學(xué)物質(zhì)的數(shù)量

其他化合物由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)無法完全鑒定，數(shù)據(jù)庫中無法檢索，需要進(jìn)一步鑒定。建立并生成了一個火山模型，進(jìn)一步表征了其顯著性差異（圖7-C）。P值小于0.001和FC大于3的變量表示與LRDBD中8種單一草藥成分不同的化合物。

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圖7-C ?8種不同單一草藥在正負(fù)離子模式下提取的LRDBD化合物的差異分析

據(jù)此，篩選出了39種化合物?？偟膩碚f，LRDBD和8種不同的單一草藥之間有39種化合物不同。該分析還反映了多種藥物的多種成分之間復(fù)雜的相互作用，這不同于單一藥物。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4、大鼠血漿中鑒定了LRDBD的原型成分29個和代謝物35個

口服LRDBD 4天后，在不同時間采集大鼠血漿樣本。我們將在所有時間點(diǎn)收集的血漿樣本混合，以獲得用于分析的劑量血漿?？瞻籽獫{和LRDBD分別作為陰性對照和陽性對照。提取的色譜峰，出現(xiàn)在給藥的血漿中和LRDBD中，而不是空白血漿中，即被確定為吸收的原型成分。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，通過將準(zhǔn)確的質(zhì)量和保留時間與LRDBD中識別的成分信息進(jìn)行比較，來確定LRDBD的可吸收成分。利用CD平臺上精確的精確質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。具體的識別過程如圖8所示。

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圖8 進(jìn)入血液中吸收的LRDBD成分的成分分析

此外，使用CD軟件比較了給藥血漿和空白血漿的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，以鑒定代謝物。在給藥的血漿中檢測到代謝物，但在空白血漿和LRDBD中沒有檢測到，并且具有與原型成分相同的離子片段。

4.1 鑒定被血液吸收的原型成分29種

根據(jù)提取離子色譜（EIC）函數(shù)，與LRDBD成分相比，鑒定出29種原型成分作為給藥血漿中的吸收成分（表2）。此外，29個原型成分中有15個原型成分來自鹿茸，這與鹿茸是主要活性成分的SM理論相一致。所吸收的成分與LRDBD中的主要活性物質(zhì)相對應(yīng)。我們的研究結(jié)果為LRDBD的進(jìn)一步研究提供了標(biāo)志性化合物和方法參考。

4.2 35種代謝產(chǎn)物的鑒定

如表3所示，用CD軟件對大鼠血漿中16種原型成分轉(zhuǎn)化的35種代謝物進(jìn)行了分析。主要發(fā)生I相代謝反應(yīng)，如硝基還原、氧化脫氨為醇、去飽和、還原、水化、氧化、脫水、氧化脫氨為酮、去甲基化和II相代謝反應(yīng)，如乙?；?、甲基化、硫酸化。

表3 大鼠血漿中LRDBD的代謝物

以M19為例，說明代謝物的鑒定過程。M19在m/z 119.08604處有一個前體離子[M+H]+，主要特征產(chǎn)物離子為m/z91.054[M+H?C2H2]+和m/z115.054[M+H?H4] +。M19的前體離子比麻黃堿小47 Da，如圖9-A所示，M19的特征片段與麻黃堿相似。根據(jù)M19的相關(guān)質(zhì)譜裂解行為，推導(dǎo)是麻黃堿去飽和+硝基還原的代謝物。此外，比較M35與硬脂酰胺的精確分子量，質(zhì)譜結(jié)果表明，m/z57.071[m+H-?C15H30NO]+為碎片離子，與硬脂酰胺的碎片離子一致。因此，M35是硬脂酰胺的II相代謝物（圖9-B）。其他的代謝物也以類似的方式被鑒定出來。

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圖9 LRDBD中原型化合物的碎片離子

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研究結(jié)論

1、本研究建立了高靈敏度、高分辨率的UHPLC--HRMS法測定LRDBD的物質(zhì)基礎(chǔ)，并將煎煮后的LRDBD與8種單藥的成分進(jìn)行比較。

2、在LRDBD中鑒定出122種化合物，包括氨基酸、苯丙素、生物堿、黃酮、脂肪酸化合物及其衍生物、黃酮類等。這是第一次對LRDBD的化學(xué)成分進(jìn)行了全面的表征。

3、在LRDBD中檢測到23種新成分是8種單藥中不存在的，可能是煎煮過程中藥物之間的化學(xué)成分相互作用。此外，統(tǒng)計分析LRDBD和8種單一藥草之間有39種化合物不同。這一結(jié)果也反映了多種藥物的多種成分之間復(fù)雜的相互作用，不同于單一藥物。

4、大鼠血漿中鑒定出29種LRDBD的原型成分和35種代謝物。去飽和、還原、水化、氧化、脫水、去甲基化、乙?；⒓谆土蛩猁}化是主要的代謝途徑。其中，鹿茸原型成分15種，在血漿中所占比例最大。上述結(jié)果與SM理論：鹿茸在哮喘治療中起主要作用相一致。本研究將有助于對哮喘癥狀指導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的藥理分析，以及發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶點(diǎn)，揭示LRDBD在哮喘治療中的作用機(jī)制。

文章推薦

1、這是一篇非常全面的對中藥復(fù)方入血成分和代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性表征及研究闡述的文章。

2、全文無論從結(jié)構(gòu)、研究方法、還是寫作思路、結(jié)果闡述、化合物解析、結(jié)論描述等各方面，都可以作為一篇給絕大多數(shù)做中藥復(fù)方藥效機(jī)制研究、入血成分分析研究的科研工作者的一個非常棒的參考范例。

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鯤?撰文

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