【文章題目】Opposing Wnt signals regulate cervical squamocolumnar homeostasis andemergence of metaplasia

【雜志名稱】Nature?Cell?Biology(IF=17.73)

【發(fā)表時(shí)間】2021年1月18日

【主要技術(shù)】10XGenomics

摘要

鱗狀上皮和柱狀上皮的過渡區(qū)是癌癥發(fā)生的熱點(diǎn)，通常在此之前會有化生，在這種情況下，一種上皮類型被另一種上皮類型取代。目前還不清楚在化生過程中上皮空間組織是如何維持的以及移行區(qū)生態(tài)位是如何重塑的。在這里，作者使用單細(xì)胞RNA測序來表征上皮亞群和子宮內(nèi)膜和子宮外內(nèi)膜的基質(zhì)亞群，包括過渡區(qū)。小鼠譜系追蹤、類器官培養(yǎng)和smRNA-ISH顯示，這兩種上皮細(xì)胞來自不同的宮頸細(xì)胞系特異性干細(xì)胞群，這些干細(xì)胞群受到來自基質(zhì)的相反的Wnt信號的調(diào)節(jié)。利用小鼠子宮頸化生模型，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)宮頸內(nèi)膜基質(zhì)發(fā)生重構(gòu)并增加Wnt抑制劑Dickkopf-2 (DKK2)的表達(dá)，促進(jìn)宮頸外干細(xì)胞的生長。本研究的數(shù)據(jù)表明，過渡區(qū)的穩(wěn)態(tài)來自于不同的基質(zhì)信號，推動了常駐上皮譜系的分化增殖。

主要結(jié)果

鱗狀上皮和柱狀上皮細(xì)胞來源不同

宮頸連接宮腔和陰道，由宮頸外和宮頸內(nèi)兩部分組成。宮頸內(nèi)壁的柱狀上皮與子宮腔相鄰，由內(nèi)口隔開，而宮頸外的鱗狀上皮伸向陰道。外口標(biāo)志著從宮頸外到宮頸內(nèi)的過渡，在那里柱狀上皮與鱗狀上皮相遇，形成鱗狀柱狀上皮交界處(SCJ)(圖1)。

作者對健康小鼠的宮頸內(nèi)膜、宮頸外和過渡區(qū)這3個組織區(qū)域進(jìn)行ScRNA-seq和聚類分析，根據(jù)細(xì)胞特異性的marker基因?qū)喨悍殖?種類型：基質(zhì)細(xì)胞(Stromal)，平滑肌細(xì)胞(SMC)，周細(xì)胞(Pericytes)，神經(jīng)細(xì)胞(Neural)，免疫細(xì)胞(Immune)，上皮細(xì)胞(Epithelial)，內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelia)(圖2b,c)。

聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸內(nèi)的細(xì)胞類型與過渡區(qū)的細(xì)胞類型相似，但宮頸外的上皮細(xì)胞(Epithelial)、基質(zhì)細(xì)胞(Stromal)、免疫細(xì)胞(Immune)和平滑肌細(xì)胞(SMC)亞群顯示出不同的轉(zhuǎn)錄譜（圖2a）。

對上皮細(xì)胞群體進(jìn)行重新聚類，揭示了兩種主要的上皮細(xì)胞類型：Krt5hi/Krt14hi鱗狀細(xì)胞(SQ)和Krt8hi/Krt19hi柱狀細(xì)胞(Co)。這些進(jìn)一步被分為六個轉(zhuǎn)錄上不同的亞群(SQ1、Sq2A、Sq2B、SQ3、CO1和CO2)，其中將肌上皮細(xì)胞(Me)歸類為Krt5hi/Krt14hi亞群，它與KRT5+細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞有相同的基因表達(dá)譜。同時(shí)也表達(dá)成纖維細(xì)胞marker即Col6a2。這些細(xì)胞可能是鱗狀細(xì)胞系的候選前體(圖3)。

SQ1亞群含絲分裂相關(guān)基因，表達(dá)Trp63、Birc5、Mki67、Cks2和Hmgb2，表明復(fù)層宮頸的基底干細(xì)胞。Sq2A和Sq2B亞群含皮膚發(fā)育和應(yīng)激或損傷反應(yīng)基因，并表達(dá)Trp63、Krt15、Dkk3和Notch1。SQ3亞群含角質(zhì)形成細(xì)胞分化和皮膚發(fā)育基因，表達(dá)Fam25c、Gm94、Krt6a和Krt10，表明鱗狀細(xì)胞分化。CO1亞群含分支上皮形態(tài)發(fā)生和脂質(zhì)分解過程相關(guān)基因，表達(dá)Anpep、Cxcl17、Krt8和Krt18。CO2亞群含應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和對未折疊蛋白的反應(yīng)基因，并表達(dá)Krt19、Ltf、Muc1和Psca(圖3)。

熒光免疫組織化學(xué)和smRNA-ISH證實(shí)KRT5和KRT8分別標(biāo)記了整個鱗狀分層和柱狀上皮細(xì)胞。作者通過Krt5-CreERT2；Rosa26-tdTomato和Krt8-CreERT2；Rosa26-tdTomato小鼠進(jìn)行譜系追蹤，Krt5+細(xì)胞僅標(biāo)記復(fù)層上皮，而Krt8+細(xì)胞僅標(biāo)記宮頸內(nèi)上皮。兩種上皮在過渡區(qū)融合，而Krt5+鱗狀細(xì)胞似乎取代了覆蓋Krt8+的柱狀細(xì)胞。結(jié)果表明這兩種上皮細(xì)胞類型來自兩個不同的譜系（圖4）。

過渡區(qū)的上皮邊界由不同的基質(zhì)Wnt信號界定作者通過類器官模型來確認(rèn)維持這兩種上皮細(xì)胞的干細(xì)胞微環(huán)境是不同的。在Wnt-的培養(yǎng)基(不含Wnt3a和Rspo1)中培養(yǎng)的宮頸內(nèi)膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生P63+，Krt5+復(fù)層的類器官，類似于宮頸外類器官。源自宮頸外的細(xì)胞僅產(chǎn)生鱗狀類器官，說明與Wnt無關(guān)。而柱狀類器官的形成是依賴于Wnt的，與鱗狀類器官的形成不同。類器官的Microarray分析表明，Wnt在宮頸內(nèi)細(xì)胞和宮頸外細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有所不同：Wnt激動劑在柱狀上皮中上調(diào)，而Wnt拮抗劑Dkk1和KREMEN1在鱗狀上皮中上調(diào)(圖5)。

為了深入了解基質(zhì)如何影響這兩種不同的宮頸上皮的動態(tài)平衡，作者結(jié)合scRNA-seq數(shù)據(jù)的聚類分析揭示了基質(zhì)細(xì)胞群的五個轉(zhuǎn)錄上不同的亞群。S1，S2和S3亞群代表宮頸內(nèi)膜移行區(qū)的細(xì)胞，通常表達(dá)Hes1，Nfkbia和Egr1。S2亞群高表達(dá)Wnt16和Axin2，S3亞群高表達(dá)Mmp3，Adh1，Ces1d，Cxcl16，Rspo1和Rspo3。亞群S4A和S4B代表宮頸基質(zhì)細(xì)胞；亞群S4A顯示Sfrp1和Bmp4的優(yōu)先表達(dá)，亞群S4B表達(dá)Dkk2和Crabp1。smRNA-ISH分析也證實(shí)了scRNA-seq數(shù)據(jù)(圖6)。

為了進(jìn)一步研究DKK2和DKK3的作用，作者將宮頸內(nèi)膜類器官重新接種在含有WNT3A和RSPO1加DKK2/DKK3/DKK2和DKK3的培養(yǎng)基中。將Wnt缺乏的培養(yǎng)基用作對照。DKK2的存在導(dǎo)致柱狀類器官大小的顯著減少，類似于在Wnt缺乏的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的那樣，這證實(shí)DKK2發(fā)揮了抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)基中還含有DKK3時(shí)，可以避免這種情況。DKK3要么對Wnt信號沒有影響，要么作為Wnt激動劑發(fā)揮作用。用Wnt抑制劑2(IWP2)阻斷Wnt信號，抑制宮頸內(nèi)類器官生長，但不影響宮頸外類器官。這表明鱗狀上皮不依賴于細(xì)胞自主的Wnt信號。

用DKK2或IWP2處理后，柱狀和鱗狀類器官中譜系特異性標(biāo)記KRT5，KRT8和p63的表達(dá)沒有差異?？傊@些數(shù)據(jù)表明宮頸的上皮由兩個不同的干細(xì)胞群體維持，它們的命運(yùn)由相反的Wnt信號微環(huán)境決定，在過渡區(qū)具有明確的開關(guān)（圖8）。

WNT拮抗劑、Notch和EGFR信號通路維持宮頸外干性和分化基因芯片分析顯示，Notch相關(guān)基因在宮頸外鱗狀類器官中的表達(dá)高于在宮頸內(nèi)柱狀類器官中的表達(dá)(圖9)。

作者通過對2D生長的宮頸外胚層細(xì)胞(2D-ECTO)、三天大的早期類器官(EO-ECTO)和兩周大的成熟類器官(DO-ECTO)進(jìn)行比較分析來確認(rèn)分化的機(jī)制。結(jié)果表明2D-ECTO和EO-ECTO的基因表達(dá)譜具有很高的相似性，但與DO-ECTO相比有著明顯差異(圖10e)。同樣的，2D-ECTO和EO-ECTO與干細(xì)胞marker的基因集中的表達(dá)譜有很高的相似性，但成熟的DO-ECTO則不同(圖10f)，這說明2D-ECTO和EO-ECTO的細(xì)胞對應(yīng)于宮頸外干細(xì)胞。對宮頸外干細(xì)胞相對于分化細(xì)胞上調(diào)的基因的調(diào)查顯示，Notch配體DLL3和MFNG高表達(dá)。而分化的細(xì)胞高表達(dá)NOTCH2和NOTCH3受體及其靶點(diǎn)，包括轉(zhuǎn)錄因子HES1和γ分泌酶的核心成分PSEN1。宮頸外干細(xì)胞也表達(dá)Dkk1及其受體KREMEN2(圖10g)。因此，使用γ-分泌酶抑制劑DBZ阻斷Notch激活會抑制類器官的生長，無法分化和分層。由此表明宮頸干細(xì)胞充當(dāng)Notch信號的來源，而分化細(xì)胞充當(dāng)Notch信號的接收細(xì)胞，其是促進(jìn)分化和上皮分層的反式激活相互作用。

GSEA富集顯示，受Notch下游轉(zhuǎn)錄因子和EGFR-Ras-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的基因在宮頸外干細(xì)胞中高度富集，包括轉(zhuǎn)錄因子AP1、CREB、ETS、NERF、ELK1、E2F、SRF、MYC和YY134-37(圖11)。這兩條途徑共同調(diào)節(jié)增殖和分化，與表皮生長因子在層狀類器官形成中的重要作用一致。相反，屬于RAS拮抗的NF1通路的基因在分化細(xì)胞中富集。這些發(fā)現(xiàn)表明，Wnt拮抗劑與EGFR和Notch誘導(dǎo)通路共同調(diào)節(jié)宮頸外干性和分化。

基質(zhì)區(qū)室的重塑導(dǎo)致Krt5+鱗狀化生的出現(xiàn)為了研究與宮頸外鱗狀上皮的干性和分化有關(guān)的信號通路和細(xì)胞類型在鱗狀化生中的作用。作者將人子宮內(nèi)膜來源的柱狀細(xì)胞放在Wnt+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，會產(chǎn)生少量的Krt5+或p63+細(xì)胞，同樣培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到類器官條件下會產(chǎn)生柱狀類器官；然而在Wnt-的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，出現(xiàn)對Krt5+和p63+細(xì)胞的顯著富集的情況，在轉(zhuǎn)移到類器官條件下，即使在Wnt3a和(或)Rspo1存在的情況下，這些細(xì)胞也只產(chǎn)生鱗狀類器官。相比之下，最初Wnt+或Wnt-的培養(yǎng)基中生長的人宮頸外細(xì)胞，在轉(zhuǎn)移到Wnt-的培養(yǎng)基后只產(chǎn)生鱗狀類器官。這表明子宮內(nèi)膜中存在鱗狀干細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境下可以產(chǎn)生Krt5+p63+細(xì)胞。

作者通過誘導(dǎo)Krt5-CreERT2；Rosa26-tdTomato和Krt8-CreERT2；Rosa26-tdTomato小鼠的譜系追蹤證實(shí)了柱狀上皮和復(fù)層宮頸上皮來自兩個不同的譜系，每一個譜系都對特定的微環(huán)境做出反應(yīng)。改變Wnt信號不會誘導(dǎo)柱狀細(xì)胞向?qū)訝罴?xì)胞的轉(zhuǎn)分化，反之亦然。

為了分析體內(nèi)的化生發(fā)展，研究人員利用了缺乏維生素A的飲食喂養(yǎng)的小鼠的模型，在該模型中，鱗狀化生的異常病灶出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜。為了確定上皮和基質(zhì)的變化，他們對從宮頸內(nèi)、宮頸外、過渡區(qū)和宮頸內(nèi)化生(即化生灶)分離的細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq和聚類分析（圖11）。

上皮群體被細(xì)分成Sq，Co和Me亞群，根據(jù)每個上皮亞群的表達(dá)譜生成的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：鱗狀細(xì)胞亞群(SQ1、Sq2A、Sq2B和SQ3)和Me細(xì)胞(Me)在轉(zhuǎn)錄上相似，但與柱狀亞群(CO1和CO2)不同。Sankey圖是用來分析每個組織區(qū)域的上皮細(xì)胞對不同亞群的轉(zhuǎn)錄貢獻(xiàn)，結(jié)果表明與健康的宮頸內(nèi)膜上皮相比，宮頸內(nèi)膜化生表現(xiàn)出與鱗狀上皮和肌上皮型相似的表達(dá)譜的擴(kuò)增(圖12)。

作者通過對宮頸內(nèi)、宮頸外、移行區(qū)和宮頸內(nèi)化生的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行重新聚類來描述基質(zhì)細(xì)胞亞群的變化(圖13a)。宮頸上皮內(nèi)化生的基質(zhì)部分與健康的宮頸內(nèi)、宮頸外和移行區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞有明顯的差異(圖13b)。，Sankey圖同樣表明了宮頸內(nèi)化生(S2B、S2C和S2D)中出現(xiàn)了與健康宮頸以及外宮頸不同的基質(zhì)細(xì)胞亞群(圖13c)。作者還觀察到Dkk2在宮頸內(nèi)化生的一個亞群中表達(dá)增加，這主要對應(yīng)于健康小鼠的宮頸外S4B。這些數(shù)據(jù)表明，在化生發(fā)育過程中，基質(zhì)發(fā)生了廣泛的改建（圖13e）。

宮頸癌SCC和ADC的基因表達(dá)模式與鱗狀和柱狀器官特征相關(guān)成體干細(xì)胞易轉(zhuǎn)化，通常構(gòu)成各種癌癥的起源細(xì)胞。到目前為止，尚不清楚ADC和SCC起源于哪種細(xì)胞類型。作者根據(jù)鱗狀和柱狀宮頸類器官的基因表達(dá)特征來確定宮頸癌起源的可能細(xì)胞。TCGA中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)將宮頸癌分為ADC和高角蛋白SCC組和低角蛋白SCC組，其中低角蛋白SCC組顯示鱗狀上皮特異性標(biāo)記物的較低表達(dá)。作者根據(jù)宮頸外鱗狀上皮和宮頸內(nèi)柱狀上皮之間差異表達(dá)的基因，將癌癥樣本分為鱗狀上皮樣和柱狀上皮樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分類為柱狀樣或鱗狀樣的癌癥與分類為ADC或SCC的組織學(xué)分類之間存在一致性；這從與ADC或角蛋白高和角蛋白低組的TCGA簇的比較中也是明顯的。

其中一組腫瘤含量低，與宮頸外或?qū)m頸內(nèi)征象無明顯相似性的病例被分類為未確定病例。然而，在62例未確定的病例中，有59例落在TCGA定義的角蛋白低或高角蛋白的鱗狀細(xì)胞癌叢中。值得注意的是被歸類為柱狀的癌癥樣本主要是KRT5low、KRT7high和TP63low，而被歸類為鱗狀和未確定的癌癥樣本主要是KRT5high和TP63high，并混有的KRT7。這表明未確定的組可能由宮頸內(nèi)或從宮頸內(nèi)長出的SCC組成，導(dǎo)致樣本中存在污染的KRT7+宮頸柱狀細(xì)胞。

研究表明位于過渡區(qū)的SCJ細(xì)胞表達(dá)KRT7、CD63、GDA、AGR2和MMP7，這些細(xì)胞是SCC和ADC19的前體細(xì)胞。因此作者研究了類器官和TCGA宮頸癌樣本中的基因表達(dá)水平，檢測了SCJ標(biāo)記物Krt5。這些標(biāo)記物在宮頸內(nèi)類器官和ADC中的表達(dá)明顯高于在宮頸外類器官和鱗癌中的表達(dá)，而Krt5的表達(dá)趨勢則相反。人和小鼠宮頸組織切片的免疫組織化學(xué)和smRNA-ISH證實(shí)Krt5在整個鱗狀上皮中均有表達(dá)。KRT7在整個柱狀上皮中表達(dá)，在較小程度上在鱗狀上皮中表達(dá)，而不是僅限于過渡區(qū)。宮頸外類器官對鱗狀上皮標(biāo)記Krt5和CTSA呈陽性反應(yīng)，而宮頸內(nèi)類器官對柱狀上皮標(biāo)記KRT7、AGR2、GDA和Kr18呈陽性反應(yīng)。這意味著已報(bào)道的SCJ細(xì)胞與宮頸柱狀細(xì)胞譜系沒有區(qū)別，也不是SCC的起源細(xì)胞。與角蛋白高和角蛋白低的鱗狀細(xì)胞癌均起源于鱗狀細(xì)胞系的觀點(diǎn)一致，該研究還揭示了高角蛋白和低角蛋白的鱗狀細(xì)胞癌和ADC組之間的差異表達(dá)基因。作者在柱狀癌和鱗狀癌(包括MUC5B、KRT5和CSTA)中觀察到雙模式基因表達(dá)，它們將ADC與SCC區(qū)分開來。SCJ的標(biāo)記物KRT7、AGR2和GDA只標(biāo)記ADC，而不標(biāo)記SCC。綜上所述，大多數(shù)宮頸癌可以根據(jù)分子特征分為兩組：SCC最可能起源于宮頸外的Krt5+鱗狀譜系，而ADC最可能起源于宮頸內(nèi)的KRT7+KRT8+柱狀譜系(圖14）。

總結(jié)

綜上所述，作者的數(shù)據(jù)表明宮頸鱗狀上皮和柱狀上皮起源于兩種不同的譜系特異性干細(xì)胞類型，并確定了這些譜系的亞群。此外，宮頸內(nèi)外有不同的基質(zhì)亞群，構(gòu)成了維持過渡區(qū)的微環(huán)境梯度。通過信號梯度調(diào)節(jié)干細(xì)胞的維持、分化和組織構(gòu)型是發(fā)育過程中的普遍原則，其中Wnt信號是不可或缺的。在基質(zhì)中存在Wnt梯度，它選擇性地驅(qū)動柱狀譜系，同時(shí)對同一組織中存在的鱗狀譜系特異性干細(xì)胞施加靜止。在鱗狀化生中，宮頸內(nèi)基質(zhì)經(jīng)歷了廣泛的改建。作者還觀察到Wnt抑制劑DKK2在基質(zhì)亞群中上調(diào)。這種向Wnt抑制微環(huán)境的轉(zhuǎn)變可能激活靜止的鱗狀上皮干細(xì)胞，這些干細(xì)胞侵入移行區(qū)的柱狀上皮或作為子宮內(nèi)膜內(nèi)的化生灶(圖15)。從分子和細(xì)胞的角度來看，目前對維持宮頸上皮連接的機(jī)制的闡明提供了一個重要的概念進(jìn)展。這表明，這些部位的動態(tài)平衡并不是通過一種上皮細(xì)胞類型向另一種上皮細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)分化來維持的。取而代之的是，成體組織類似于不同譜系特異性干細(xì)胞群體的整合，由微環(huán)境對外部或內(nèi)部信號做出反應(yīng)而激活。粘膜過渡區(qū)動態(tài)平衡的這一概念與最近對粘膜干細(xì)胞鑒定的其他觀察結(jié)果非常吻合，并為將來在其他具有高度臨床意義的組織中研究過渡區(qū)動態(tài)平衡提供了基礎(chǔ)。