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二維凝膠電泳 (2-DE) 被認為是蛋白質(zhì)組學工作的有力工具。 它用于從生物樣品中分離和分離復雜的蛋白質(zhì)混合物。 2-DE 根據(jù)兩個不同的步驟分離蛋白質(zhì)：第一個稱為等電聚焦 (IEF)，根據(jù)等電點 (pI) 分離蛋白質(zhì)； 第二步是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），它根據(jù)分子量（相對分子量，Mr）分離蛋白質(zhì)。 因此，可以分離數(shù)千種蛋白質(zhì)，并獲得有關(guān) IEF 和分子量的信息。 2-DE 是一種廣泛使用的蛋白質(zhì)分析方法，能夠一次分離數(shù)千種蛋白質(zhì)。 它可以提供蛋白質(zhì)/翻譯后修飾 (PTM) 豐度變化的直接視覺信息。 它還可以用于其他分析，例如全蛋白質(zhì)組分析、生物標志物檢測、藥物發(fā)現(xiàn)等。 成功的 2-DE 分析有幾個步驟。

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樣品制備

說到樣品制備，天然樣品需要轉(zhuǎn)化為適合第一維 IEF 的物理化學狀態(tài)，并保持組成蛋白質(zhì)的天然電荷和 Mr。 為了獲得良好的結(jié)果，適當?shù)臉悠分苽浔夭豢缮佟?由于蛋白質(zhì)的種類和來源不同，樣品制備也不同。 理想情況下，該過程將導致樣品中蛋白質(zhì)的完全溶解、分解、變性和還原。

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第一維：等電聚焦 (IEF)

正如我們上面提到的，第一維根據(jù)蛋白質(zhì)的 pI 分離蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)是兩性分子，它們攜帶的正、負或零凈電荷取決于周圍環(huán)境的 pH 值。 等電點 (pI) 定義為蛋白質(zhì)凈電荷變?yōu)榱銜r溶液的 pH 值。 具有正凈電荷的蛋白質(zhì)將向陰極遷移，在達到其 pI 之前帶正電荷減少。 而帶負凈電荷的蛋白質(zhì)將向陽極遷移，帶負電荷減少，直到它也達到其 pI。

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具體而言，將蛋白質(zhì)混合物加載到 pH 梯度凝膠的堿性端。 施加電場后，蛋白質(zhì)根據(jù)電荷分離，集中在 pl 值等于周圍 pH 值的位置。 較大的蛋白質(zhì)在凝膠中的移動速度較慢，但如果有足夠的時間，就會趕上帶相同電荷的小蛋白質(zhì)。

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第二維：SDS-PAGE

第一維之后，第二維分離可以在平板凝膠上的平板或垂直系統(tǒng)上進行。 第二維通常通過SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳）進行，這是一種根據(jù)多肽的分子量（Mr）分離多肽的電泳方法。 該方法通常包括四個步驟，包括凝膠的制備、固定化 pH 梯度 (IPG) 膠條在 SDS 緩沖液中的平衡、將平衡后的 IPG 膠條置于 SDS 凝膠上以及最后處理電泳。

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SDS可以使蛋白質(zhì)變性并以恒定的摩爾比結(jié)合到主鏈上。 當應用 SDS 和還原劑（如 DTT 可以裂解二硫鍵）時，蛋白質(zhì)展開成線性鏈，負電荷與多肽鏈長度成正比。 聚丙烯酰胺形成適合分離蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀基質(zhì)。 當通過 SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)時，較小的蛋白質(zhì)由于阻力較小而遷移得更快。

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結(jié)果可視化：染色

有多種蛋白質(zhì)可視化方法，但最常用的是考馬斯藍染色和銀染。 銀染是一種靈敏且無放射性的方法。 銀染的原理很簡單。 氨基酸側(cè)鏈可以與銀離子結(jié)合，主要是蛋白質(zhì)的巰基和羧基，然后還原為游離金屬銀。 結(jié)果，蛋白質(zhì)條帶被可視化為發(fā)生還原的點。 銀染因其靈敏度（在極低的 ng 范圍內(nèi)）而適用于低蛋白水平。

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考馬斯藍染色是一種相對簡單的方法，比銀染更定量。 適用于檢測含有約0.2μg或更多蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)條帶。 考馬斯染料通過范德瓦爾斯吸引力與蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白質(zhì)-染料復合物。 考馬斯亮藍染料有兩種，R250和G-250。

進一步分析蛋白質(zhì)。

在具有數(shù)千個點的大型研究中，幾乎不可能檢測到幾個新點的出現(xiàn)或單個點的消失。 此外，通過人工比較來評估兩種凝膠也是不可能的。 因此，有必要通過圖像采集硬件和圖像評估軟件來檢測差異并從凝膠中獲取信息。 有一些二維凝膠分析軟件，如Melanie、PDQuest、Progenesis、REDFIN等，凝膠可用于質(zhì)譜鑒定等應用。