分子自組裝是自然界最本質(zhì)的內(nèi)容之一。然而，聚合物的水相自組裝仍是自組裝領(lǐng)域內(nèi)亟待應(yīng)對的主要挑戰(zhàn)?；诖?，我們提出了一種在水相中通過MnO2成核誘導水溶性嵌段共聚物自組裝制備可控形態(tài)和高穩(wěn)定性聚合物囊泡的方法。在該聚合物囊泡中，MnO2不僅可以作為交聯(lián)劑穩(wěn)定聚合物囊泡結(jié)構(gòu)，而且在谷胱甘肽作用下能夠發(fā)生分解，進而促使聚合物囊泡解離。鑒于以上特性，我們將其應(yīng)用于腫瘤微環(huán)境觸發(fā)的抗腫瘤藥物遞送，發(fā)現(xiàn)該藥物遞送系統(tǒng)不僅具有優(yōu)異的腫瘤抑制作用，還能克服抗腫瘤藥物阿霉素的心臟毒性。

Aqueous Self-Assembly of Block Copolymers to Form Manganese Oxide-based Polymeric Vesicles for Tumor Microenvironment-activated Drug Delivery

Yalei Miao, Yudian Qiu, Mengna Zhang, Ke Yan, Panke Zhang, Siyu Lu, Zhongyi Liu*, Xiaojing Shi*, Xubo Zhao*

Nano?Micro Lett.(2020)12:124

https://doi.org/10.1007/s40820-020-00447-9

本文亮點

1.?利用二氧化錳成核誘導嵌段共聚物水相自組裝形成聚合物囊泡。

2.?聚合物囊泡具有優(yōu)異的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，磷酸鹽緩沖溶液中100天不聚沉。

3.?聚合物囊泡藥物遞送系統(tǒng)具有良好的腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性，展現(xiàn)出較高的腫瘤抑制能力，且能克服阿霉素的心臟毒性。

內(nèi)容簡介

鄭州大學化學學院趙旭波、劉仲毅老師團隊和鄭州大學動物實驗中心石曉靜老師合作提出了一種簡單有效的水相自組裝構(gòu)筑聚合物囊泡的方法，并將其應(yīng)用于抗腫瘤藥物遞送。具體步驟如下：通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合、點擊化學、水解反應(yīng)制備得到兩親性嵌段共聚物，并在水相中溫和條件下，配位介導吸附Mn2+，利用MnO2原位成核誘導嵌段共聚物(PAA68–b–PEG86–b–PAA68)自組裝，形成聚合物組裝體(PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2)。該組裝體形態(tài)為粒徑約30 nm的囊泡，其在生理介質(zhì)中具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，且DOX的封裝效率和載藥量均高達94%。在腫瘤組織中高水平GSH和弱酸性響應(yīng)下，MnO2轉(zhuǎn)化為Mn2+，促進了PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2的分解，實現(xiàn)抗腫瘤藥物的遞送。特別地，體內(nèi)研究證明DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2可以克服DOX的心臟毒性。

MnO2成核誘導嵌段共聚物自組裝過程分三個步驟進行：(i)在初始階段將共聚物鏈完全溶解在水相中；(ii)MnO2成核過程降低了PAA嵌段的可溶性以驅(qū)使其進行相分離；(iii)在最后階段PAA/MnO2鏈成核誘導共聚物自組裝。此過程中，MnO2成核不僅誘導了嵌段共聚物進行原位自組裝，而且還扮演了調(diào)節(jié)嵌段共聚物自組裝過程的交聯(lián)劑，以優(yōu)化其形態(tài)且增強其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。該方法不僅為聚合物自組裝結(jié)構(gòu)的拓展提供了一種新的思路，也展示了刺激響應(yīng)性聚合物組裝體在藥物遞送領(lǐng)域內(nèi)的潛在應(yīng)用。

圖文導讀

I?PAA68-b-PAA86-b-PAA68的制備

如圖1a所示，除內(nèi)部亞甲基和甲基的特征質(zhì)子峰外，在1.44 ppm處的特征峰表明PtBA–b–PEG86–b–PtBA中叔丁基(-C(CH3)3)的存在。通過定量計算a與c的峰面積比得到tBA的聚合度，并成功獲得了結(jié)構(gòu)明確的PtBA68–b–PEG86–b–PtBA68嵌段共聚物。依據(jù)圖1b所示的凝膠滲透色譜結(jié)果，PtBA68–b–PEG86–b–PtBA68的Mn為24916 Da，這與PtBA68–b–PEG86–b–PtBA68的1H NMR光譜結(jié)果吻合。此外，PtBA68–b–PEG86–b–PtBA68的PDI(Mw/Mn)為1.24，表明其存在窄的Mw分布。另外，圖1c顯示在1735 cm-1和1394 cm-1處的特征吸收峰分別歸屬于Br–PEG86–Br的酯羰基與PtBA68–b–PEG86–b–PtBA68的叔丁基。這與1H NMR光譜分析的結(jié)果一致。在PAA68–b–PEG86–b–PAA68的1H NMR光譜中，叔丁基的特征質(zhì)子峰消失，表明PtBA68–b–PEG86–b–PtBA68中叔丁基的成功水解。此外，在PAA68–b–PEG86–b–PAA68的FT-IR光譜中，1735 cm-1處叔丁基羧基的伸縮振動吸收峰消失，表明它是由PtBA68–b–PEG86–b–PtBA68生成的。因此，所制備的PAA68–b–PEG86–b–PAA68共聚物具有豐富的羧基，可用于螯合Mn2+。

圖1.?(a)1H NMR譜圖：HO–PEG86–OH(Ⅰ)、Br–PEG86–Br(Ⅱ)、PtBA68–b–PEG86–b–PtBA68(Ⅲ)和PAA68–b–PEG86–b–PAA68(Ⅳ)；(b)GPC色譜圖：HO–PEG86–OH和PtBA68–b–PEG86–b–PtBA68；(c)FT-IR光譜圖：HO–PEG86–OH、Br–PEG86–Br、PtBA68–b–PEG86–b–PtBA68和PAA68–b–PEG86–b–PAA68。

II?PAA68-b-PAA86-b-PAA68/MnO2的制備

如圖2a所示，PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2為直徑約30 nm的囊泡，這與使用高角度暗場掃描透射電子顯微鏡(HADDF-STEM，圖2b)和原子力顯微鏡(AFM，圖2d和e)的結(jié)果一致。此外，PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2的HADDF-STEM圖像也顯示了其囊泡形態(tài)。如圖2f所示，O和Mn元素在聚合物囊泡中均勻分布，表明Mn2+轉(zhuǎn)化為了MnO2。此外，該結(jié)果與圖2g中的EDS分析和圖2h中的XPS結(jié)果一致，這進一步證實了MnO2的存在。為了確認錳元素的化學價，圖2k中給出了Mn2p的精細譜。如圖2i、j和k所示，樣品的C1s光譜分為三個峰，284.8、286.7和288.2 eV分別歸屬于C-H/C-C、C-O-C和C=O，這表明了共聚物的存在；在O1s的精細譜中，位于530.6 eV處的特征峰，表明這個雜化物結(jié)構(gòu)中有MnO2的存在；在Mn2p光譜中，在結(jié)合能653.1和641.1 eV處的兩個特定峰，表明MnO2中存在Mn4+。另外，在圖2c中，PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2囊泡的HR-TEM圖像中晶面間距為1.57和3.14?，MnO2的特征晶格條紋的出現(xiàn)進一步證明了MnO2的存在。此外，通過ICP-MS測定PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2囊泡中MnO2的含量約為4 wt%。

圖2.?PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2的(a)TEM、(b和f)HADDF-STEM、(c)HR-TEM、(d和e)AFM圖像、(g)EDS、(h)XPS光譜和(i)C1s、(j)O1s、(k)Mn2p的精細譜。

III?藥物遞送系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和可降解性

如圖3a中DLS所示，PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2結(jié)構(gòu)的流體動力學直徑要比TEM下觀察到的尺寸要大，這歸因于在水相中PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2結(jié)構(gòu)中親水性PEG片段的極度伸展，而這些片段在TEM視野下是塌陷的。如圖3b顯示，在110h內(nèi)，PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2表現(xiàn)出一系列穩(wěn)定的流體動力學直徑。另外，依據(jù)不同時間點的丁達爾效應(yīng)，證明PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2結(jié)構(gòu)具有出色的穩(wěn)定性。與圖3c所示的新鮮PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2相比，圖3d所示的經(jīng)酸和還原性雙敏感觸發(fā)劑(pH 5.0和10 mM GSH)處理后的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2，觀察到PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2的分解。
與圖3e中PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2囊泡的Dh相比，圖3a中DOX負載后的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2囊泡的Dh增加，這表明DOX分子的成功負載。圖3f中評估了DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，這表明其在PBS中，110 h時間內(nèi)表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性。此外，如圖3f所示，觀察到分散體系在不同時間點的丁達爾效應(yīng)，證明了DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。

如圖3h和j所示，經(jīng)酸和還原性雙敏感觸發(fā)劑(pH 5.0含10 mM GSH)處理后，觀察到DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2的形貌變化，表明DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2的分解。這些包括PEG和PAA在內(nèi)的可降解產(chǎn)物已獲得美國食品和藥物管理局(FDA)的批準。此外，釋放出來的包括Mn2+在內(nèi)的其他產(chǎn)物均易于被腎臟代謝。如圖3i所示，MnO2向Mn2+的轉(zhuǎn)化可能有助于PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2的分解。這將促進聚合物-無機雜化物作為藥物遞送系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，尤其是在以抗癌藥物為重點的癌癥治療方面。

圖3.?(a)PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2的Dh分布；(b)在PBS中不同時間的流體動力學粒徑和丁達爾效應(yīng)；PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2降解前(c)和后(d)的TEM圖像；DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2的(e)Dh分布以及(f)在不同時間的PBS中的流體動力學粒徑和丁達爾效應(yīng)；DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2解離前(g)和后(h)的TEM圖像；在pH 5.0含10 mM GSH的PBS中，(i)PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2和(j)DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2降解的示意圖。

IV?載藥PAA68-b-PAA86-b-PAA68/MnO2的體外釋放

如圖4a所示，DOX釋放曲線表明在正常生理條件下，僅有6%的藥物累積釋放，而隨著pH從6.5降至5.0，在60 h內(nèi)藥物的累積釋放量分別為22%和50%。與此同時，與圖4a中pH 7.4條件下相比，引入10μM GSH只會稍微增加DOX的釋放。

pH 5.0含10 mM GSH(生物學相關(guān)水平為2-10 mM)的條件明顯促進了DOX的釋放，并且在24 h內(nèi)觀察到了DOX的釋放行為。特別地，如圖4a所示，在pH 5.0含10 mMGSH下，DOX的最終累積釋放量高達75%。如圖4b所示，在不同的時間間隔評估了DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2中DOX在細胞內(nèi)的釋放。如圖4c所示，與游離DOX相比，在每個培育時間內(nèi)，DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2在細胞內(nèi)釋放緩慢，這表明DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2先進行降解隨后進行釋放藥物。

當培育時間增加到12 h時，DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2幾乎釋放了所有藥物，這與DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2中DOX的累積釋放行為基本一致。如圖4a所示，在pH 5.0含10 mM GSH存在下，采用CLSM技術(shù)檢測MCF-7細胞中從DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2中釋放的DOX分子在細胞內(nèi)的分布。共培育9 h后，與圖4e中游離的DOX相比，圖4d中DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2在細胞核處觀察到了更明顯的DOX分子的紅色熒光，這表明DOX負載的AA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2可更有效地將DOX分子遞送至細胞核內(nèi)。這些結(jié)果表明，聚合物囊泡在腫瘤的酸和還原性雙重觸發(fā)下，實現(xiàn)了DOX的按需釋放。

圖4.?(a)在模擬體液中，DOX從DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2中的累積釋放量；(b)在不同時間范圍內(nèi)，MCF-7細胞中從DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2中釋放至細胞內(nèi)的DOX；(c)游離DOX作為對照組；(d)培育9 h后，從DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2中釋放至細胞內(nèi)的DOX進行CLSM測試；(e)游離DOX作對照組，比例尺：50 μm。對于CLSM和流式細胞數(shù)分析，等效DOX劑量為2.5 μg mL-1。

V?載藥PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2的體內(nèi)治療作用

在帶有MCF-7腫瘤的小鼠中，評估了DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2在體內(nèi)的抗腫瘤療效。如圖5a所示，31天后，鹽水組的腫瘤明顯增大。此外，PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2組的腫瘤大小也顯示出相似的趨勢。而與鹽水組和PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2組相比，用DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2治療31天后的腫瘤明顯變小。這種減小趨勢與游離DOX組的結(jié)果一致，表明DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2表現(xiàn)出優(yōu)異的抗腫瘤療效。如圖5b所示，實驗結(jié)束時將這些小鼠的腫瘤組織切除并稱重，結(jié)果表明，與游離DOX組相比，DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2組表現(xiàn)出了相似的腫瘤抑制作用。如圖5c所示，在治療期間，DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2組的小鼠體重與PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2組的小鼠體重相似。特別地，在31天后，游離DOX組的小鼠體重明顯降低了約24%，說明了DOX的嚴重毒副作用。如圖5d所示，DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2和游離DOX組的腫瘤大小分別從約100 mm3略微增加到約220和290 mm3。相反，PAA68–b–PEG86–b–PAA68組的腫瘤大小明顯從約100 mm3增加到約910 mm3。如圖5e所示，根據(jù)主要器官的組織學分析，在這些組織中，DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2并未引起明顯的病理變化，而游離DOX組則引起了明顯的病理變化。特別地，DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2組的肝臟和心臟證明了DOX的心臟毒性。上述觀察到的所有結(jié)果均表明，DOX負載的PAA68–b–PEG86–b–PAA68/MnO2表現(xiàn)出了更高的腫瘤抑制性，而未發(fā)現(xiàn)已知的DOX心臟毒性，這很可能是與MnO2-聚合物雜化物獨特的囊泡結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖5.?MCF-7腫瘤小鼠在體內(nèi)癌癥化療31天后切除的(a)腫瘤圖像(比例尺：1 cm)和(b)腫瘤重量；在治療期間MCF-7腫瘤小鼠的(c)體重變化和(d)腫瘤大小變化；(e)在體內(nèi)進行癌癥化療31天后，MCF-7腫瘤小鼠主要組織的切片分析，比例尺：200 μm。

作者簡介

趙旭波
本文通訊作者
鄭州大學?碩士生導師

▍主要研究領(lǐng)域

主要致力于刺激響應(yīng)性聚合物結(jié)構(gòu)設(shè)計及聚合物組裝結(jié)構(gòu)過程控制的研究，同時探索其在生物醫(yī)學領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。

▍主要研究成果

在Biomacromolecules、Polym. Chem.、ACS Appl. Mater. Interface、J. Mater. Chem. B、Bioconjugate Chem.、Langmuir及Mol. Pharmaceutics等學術(shù)期刊以第一作者或通訊作者發(fā)表論文20余篇，申請中國發(fā)明專利3項。主持國家自然科學基金青年基金、中國博士后科學基金及中央高校基本科研業(yè)務(wù)費等項目。

▍Email:?xbz2016@zzu.edu.cn

撰稿：原文作者

編輯：《納微快報》編輯部

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