在《我在島嶼讀書》中，作家們看到海中的燈塔，不禁想到弗吉尼亞·伍爾夫的小說《到燈塔去》，并折服于她所寫的“她經(jīng)常感覺到，她不過是一塊吸飽了人類各種各樣感情的海綿罷了”。而科學家們看到這樣的情景感興趣的是，人們調(diào)用這些記憶時，大腦進行的一系列神經(jīng)活動，如神經(jīng)元內(nèi)動作電位的變化、AMPA受體的上膜、相關基因的表達等，以及如何直觀地從多尺度對這些活動進行檢測。

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2023年8月18日，天橋腦科學研究院（Tianqiao and Chrissy Chen Institute，TCCI）和哥倫比亞大學神經(jīng)技術(shù)中心（NTC）、多諾斯蒂亞國際物理中心（DIPC）聯(lián)合舉辦了在線學術(shù)會議NanoNeuro 2023。本次會議上，來自哈佛大學的Adam E. Cohen教授以“映射記憶的分子工具（Molecular tools for mapping memories）”為題，從高速生物電動力學、突觸可塑性、全腦范圍內(nèi)基因表達的改變?nèi)齻€方面介紹了其實驗室近期圍繞記憶過程（不局限于記憶的研究）所開發(fā)的一系列分子工具。

捕捉樹突樹上的“星星”

神經(jīng)元的樹突參與傳遞兩個方向的神經(jīng)信息。一個方向是從樹突到胞體，樹突可以整合來自突觸的輸入信息，確定胞體動作電位時間；另一方向是從胞體到樹突。樹突也可以整合來自胞體的反向傳播動作電位和突觸輸入信息一起調(diào)控突觸強度的變化（也就是常說的突觸可塑性）。而在任一方向上傳播的電信號都會遇到一系列不同的離子通道，這些離子通道會賦予樹突以非線性和歷史依賴性的動作電位。

那么，樹突是如何執(zhí)行突觸輸入信息整合和動作電位反向傳播這些獨特任務的呢？更普遍地說，樹突的生物物理學特征和樹突雙向信息處理功能之間的關系是什么？

人們希望可以在任意空間和時間范圍內(nèi)對神經(jīng)元施加刺激，然后追蹤整個樹突樹電壓的動態(tài)變化過程來一探究竟?；诖耍珹dam E. Cohen教授團隊通過整合靶向光遺傳學刺激、熒光電壓指示器和結(jié)構(gòu)照明顯微鏡技術(shù)，開發(fā)了一種可以測量整個樹突樹電壓變化的工具。該工具可對光敏感通道蛋白CheRiff和化學遺傳電壓指示蛋白Voltron2進行化學修飾，提高其在樹突中的表達。

為了驗證該工具的可行性，他們在小鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元中構(gòu)建了上述兩個基因的雙順反子表達載體，并制備了急性腦片，通過以下步驟制成了高時空分辨率圖像。

1. 通過雙光子顯微鏡制作高分辨率的結(jié)構(gòu)圖像。

2. 將光遺傳學刺激和結(jié)構(gòu)化照明的高速電壓成像（圖1，a-b）技術(shù)相結(jié)合。

3. 統(tǒng)籌結(jié)構(gòu)和功能數(shù)據(jù)，制成高時空分辨率圖像。

這種圖像可以顯示反向傳播動作電位的時間和振幅（圖1，c-e）。同時也能夠以25μs的分辨率揭示了動作電位波面運動的細節(jié)（圖1，f）。

在后續(xù)的實驗中，他們發(fā)現(xiàn)動作電位在遠端樹突中的歷史依賴性傳播是由局部生成的鈉離子鋒電位（dSpike）驅(qū)動的。另外，樹突的去極化會引起dSpike的瞬時傳播。再者，dSpike與突觸輸入的整合將觸發(fā)NMDA受體依賴性高原電位。上述實驗結(jié)果結(jié)合數(shù)值模擬，有望在樹突的生物物理學特征與突觸可塑性之間建立知識連接。

【記者注】

樹突（dendrite）：是神經(jīng)元解剖結(jié)構(gòu)的一部分，是從神經(jīng)元胞體發(fā)出的多分支突起。樹突為神經(jīng)元的輸入通道，其功能是將自其他神經(jīng)元所接收的動作電位（電信號）傳送至細胞本體。其他神經(jīng)元的動作電位借由位于樹突分支上的多個突觸傳送至樹突上。樹突在整合這些突觸所接收到的信號、以及決定此神經(jīng)元將產(chǎn)生的動作電位強度上，扮演了重要的角色。

動作電位的反向傳播（back-propagating action potential，bAP）：該概念是相較于動作電位的正向傳播而言的。動作電位的正向傳播即動作電位通常由神經(jīng)元軸突近胞體端處的軸突起始段啟動，沿著軸突向突觸前末梢傳遞；動作電位的傳播方式具有雙向性，除了從胞體到軸突末梢的正向傳播以外，還可以從胞體向樹突末梢的方向反向傳播。動作電位的反向傳播是樹突樹神經(jīng)元信號整合和突觸可塑性的關鍵。

樹突整合原則（dendritic integration rule）：樹突是神經(jīng)元的主要接收元件。它們的作用就像天線，從成千上萬（有時是數(shù)萬甚至數(shù)十萬）的突觸前輸入中獲取信息。樹突樹復雜的幾何結(jié)構(gòu)，以及其主動和被動特性，使神經(jīng)元能夠?qū)ζ漭斎氲男畔⑦M行一系列復雜計算。了解單個神經(jīng)元如何整合它們接收到的數(shù)千個突觸輸入對于理解大腦如何工作至關重要。

關聯(lián)可塑性原則（associative plasticity rule）：當長時程增強（LTP）誘導高頻刺激應用于另一個獨立強輸入時，在激活的輸入中誘導突觸傳遞效能的長期持續(xù)增加。在弱輸入中，高頻刺激（例如100 Hz持續(xù)1 s）常不能誘發(fā)LTP;然而，當弱輸入與另一獨立強輸入的高頻刺激同時被刺激時，弱輸入也可以表現(xiàn)出LTP。這種類型的LTP被稱為“關聯(lián)LTP”。

dSpike：為dendritic spike（樹突鋒電位）的縮寫。在本文中，無論在什么位置對神經(jīng)元施加刺激，鋒電位總是從神經(jīng)元胞體開始，然后傳回樹突。在胞體處的鋒電位具有相似的波形，但遠端樹突處的鋒電位卻顯示出不同的bAP傳播基序。

給新上膜的受體換個顏色

突觸強度的改變是學習和記憶的重要組成部分。但哪些突觸代表哪些記憶，以及突觸強度的變化與其他記憶標記物（如即早期基因的表達）之間的關系，目前尚不明確。為了回答這些問題，Adam E. Cohen教授團隊開發(fā)了一種新技術(shù)，即神經(jīng)元細胞外蛋白質(zhì)表面標記（EPSILON），通過用染料標記細胞膜表面AMPA受體，繪制神經(jīng)元中特定時間窗內(nèi)的突觸強度變化圖譜。

以往的研究表明，神經(jīng)元突觸中AMPA受體的密度是突觸強度的重要表征。在記憶形成過程中，儲存在神經(jīng)元內(nèi)囊泡中的AMPA受體會與突觸后膜融合，輸送到細胞膜上。于是，他們將標記HaloTag（HT）蛋白融合到GluA1的N末端（圖2，A），并在神經(jīng)元中表達HT-GluA1，然后通過直接注射HaloTag配體（HTL）染料（圖2，B），與神經(jīng)元表面的HT-GluA1受體結(jié)合。過一段時間后，添加不同顏色的染料來標記新暴露在細胞膜表面的HT-GluA1。因此，不同時間暴露在細胞膜表面的HT-GluA1將會被標記為不同的顏色。如果動物處于學習狀態(tài)下（圖2，C），這一技術(shù)將會對動物學習記憶過程前后膜上HT-GluA1的變化進行溯源。最后，使用離體多色成像，將展示大量腦組織和不同腦區(qū)AMPA受體胞吐過程的單突觸分辨率圖譜。

海馬區(qū)對空間記憶形成和存儲是必要的，但目前對海馬印跡或記憶痕跡的物理學本質(zhì)仍不清楚，突觸水平和細胞水平記憶編碼之間的關系也尚不清晰。Adam E. Cohen教授團隊基于EPSILON技術(shù)，繪制了情境恐懼條件反射下，海馬CA1錐體神經(jīng)元的突觸可塑性和cFos基因表達的圖譜。相較于對照組，在情景恐懼條件反射的小鼠中，他們發(fā)現(xiàn)突觸可塑性程度與cFos基因表達水平密切相關。這一發(fā)現(xiàn)提示了cFos基因表達與記憶印跡相關的突觸分子機制。他們還觀察到，與遠端突觸相比，神經(jīng)元胞體周圍的突觸可塑性更強。

上述實驗表明，基于AMPA受體的EPSILON技術(shù)是研究突觸可塑性的有力工具。同時EPSILON技術(shù)也有望應用于標記其他跨膜蛋白。

【記者注】

AMPA受體：α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑受體（也稱為AMPAR）是一種谷氨酸能離子型跨膜受體（iGluR），其介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的快速興奮性突觸傳遞。在突觸后膜中動態(tài)表達，與長時程增強、長時程抑制等生物過程的觸發(fā)和維持有關，參與調(diào)節(jié)學習記憶活動。

空間記憶：對環(huán)境信息和空間方位的記憶。

情境恐懼條件反射：從操作的角度來看，情境恐懼條件反射可能是最簡單的學習形式。將嚙齒動物（小鼠）引入新的實驗環(huán)境中，幾分鐘后，一次或多次電擊其足部。隨后，再次返回新環(huán)境時，小鼠將依然表現(xiàn)出特征性恐懼行為，即使不再被電擊。

即早期基因（Immediate-early genes，IEG）：細胞中一組受到外部刺激后迅速并短暫激活的基因，這些基因的激活不需要其他基因的表達。與之相對的是，一些下游的、需要即早期基因表達產(chǎn)物激活的基因。在神經(jīng)科學中，即早期基因被廣泛用作神經(jīng)元可塑性的標記物。

在神經(jīng)元內(nèi)嵌入彩色“年輪”

生物學長期發(fā)展目標之一是繪制生物體內(nèi)基因的動態(tài)表達圖譜，這些圖譜將有助于揭示大腦活動、胚胎發(fā)育或疾病進展等重要生物學過程中基因的時空表達特征。細胞是最小的生命系統(tǒng)，如何實現(xiàn)在細胞內(nèi)記錄特定基因表達的時間窗，也是Adam E. Cohen教授團隊好奇的重要科學問題。在自然界中，樹木通過一圈又一圈的年輪，記錄時間的流逝。那么，在細胞中是否可以同樣構(gòu)建出類似年輪的分子時鐘，來映射細胞內(nèi)特定事件的時間窗呢？為此，他們研發(fā)出了在單個細胞內(nèi)，通過構(gòu)建蛋白質(zhì)組裝體來記錄細胞內(nèi)歷史的分子工具。

這個工具主要由三個部分組成（圖3，a-d）。

首先，一個蛋白質(zhì)支架。這種蛋白質(zhì)支架可以在哺乳動物細胞中表達，由單鏈多肽組裝形成，晶體結(jié)構(gòu)已知，其延伸不會干擾細胞正常的生理過程，以及可以攜帶熒光標記并且所攜帶的熒光標記不會破壞蛋白質(zhì)支架的整體結(jié)構(gòu)。通過大量的篩選，Pak4激酶催化結(jié)構(gòu)域與其抑制劑Inka1的氨基酸iBox結(jié)構(gòu)域所形成的融合蛋白是實驗中理想的蛋白質(zhì)支架的元件（以下稱為iPAK4），其可以在細胞內(nèi)穩(wěn)定地組裝成桿狀晶體。

其次，一種可以將蛋白質(zhì)支架的長度與外部世界時間校準的方法。使用HT（HaloTag）與iPAK4的融合蛋白，可以構(gòu)建基準時間戳。不同顏色的HT配體染料交替注射可以產(chǎn)生顏色邊界，其位置將對應已知的時間。

最后，可以穩(wěn)定地結(jié)合到支架中，具有轉(zhuǎn)錄活性的eGFP熒光報告基因。通過測量蛋白質(zhì)支架上eGFP標記相對于基準時間戳的位置，可以大致推斷感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的時間。

隨后，Adam E. Cohen教授團隊在HEK細胞和小鼠海馬神經(jīng)元中，對cFos基因的啟動子的轉(zhuǎn)錄激活進行了記錄，證明了該系統(tǒng)的有效性。

工欲善其事，必先利其器。人們對世界的認識，離不開日新月異的技術(shù)的發(fā)展。Adam E. Cohen教授團隊研發(fā)的一系列分子工具，將有助于開展對記憶等生物學過程中神經(jīng)活動的監(jiān)測。未來，神經(jīng)技術(shù)的突破也將助力大腦奧秘的揭露。

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