Wienands和Reth等人開(kāi)創(chuàng)性工作表明，單獨(dú)用過(guò)氧化氫處理就可誘導(dǎo)BCR信號(hào)(Wienands et al. 1996)，提示BCR信號(hào)對(duì)ROS敏感。后續(xù)的研究表明，BCR交聯(lián)后一分鐘即可檢出ROS的產(chǎn)生(Singh et al. 2005)。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)缺乏NOX2的B細(xì)胞在BCR交聯(lián)后不會(huì)立即生成ROS，故這種快速響應(yīng)由NOX2介導(dǎo) (Richards and Clark 2009)?；趯?duì)氫電壓門(mén)控通道1(HVCN1)缺陷B細(xì)胞的研究，進(jìn)一步證實(shí)NOXes在BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。作為一種質(zhì)子通道，HVCN1為NOX介導(dǎo)ROS的產(chǎn)生提供基礎(chǔ)(Capasso et al. 2011)。具體來(lái)說(shuō)，H離子作為NOX介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的副產(chǎn)品，HVCN1將其轉(zhuǎn)出細(xì)胞質(zhì)，以達(dá)到膜內(nèi)外電荷的重新平衡（圖3.1a）。HVCN1敲除的B細(xì)胞會(huì)抑制NOX2而阻礙ROS快速產(chǎn)生，并且伴隨BCR交聯(lián)出現(xiàn)的Syk和Akt的磷酸化水平降低，B細(xì)胞的增殖也略微延遲(Capasso et al. 2010)，展現(xiàn)出NOXes在BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。然而，NOX2敲除的B細(xì)胞BCR信號(hào)卻總體正常，包括細(xì)胞增殖、鈣流動(dòng)和Syk、Erk及Akt的磷酸化等(Richards和clark2009)。因此，NOX2介導(dǎo)的BCR交聯(lián)后ROS的即刻產(chǎn)生并不影響B(tài)CR信號(hào)?？紤]到HCNV1還通過(guò)NOX非依賴途徑發(fā)揮功能，如嗜堿性粒細(xì)胞組胺的釋放(Capasso et al. 2011)，可以合理推測(cè)其也可能通過(guò)NOX非依賴的機(jī)制干預(yù)Syk和Akt的磷酸化。

?盡管BCR交聯(lián)后快速產(chǎn)生的ROS不參與BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但Wheeler和DeFranco(2012)證明了ROS產(chǎn)生過(guò)程延長(zhǎng)的潛在影響。他們?cè)贐CR交聯(lián)6小時(shí)后利用一種靶向線粒體超氧化物的指示劑檢測(cè)到該細(xì)胞器內(nèi)ROS的產(chǎn)生，且持續(xù)清除ROS可顯著抑制Akt通路并限制交聯(lián)后48小時(shí)B細(xì)胞增殖。以上結(jié)果說(shuō)明線粒體ROS生成延長(zhǎng)可能涉及BCR交聯(lián)誘導(dǎo)的B細(xì)胞活化。

最近我們證實(shí)了長(zhǎng)時(shí)程ROS產(chǎn)生在BCR交聯(lián)誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖中的重要作用(Feng et al. 2019)。當(dāng)小鼠脾B細(xì)胞BCR交聯(lián)后，ROS的產(chǎn)生可分為兩大階段。首先是BCR交聯(lián)后立即開(kāi)始至一小時(shí)后停止；其次一輪ROS的產(chǎn)生在交聯(lián)后2小時(shí)重新開(kāi)始，且這一過(guò)程持續(xù)4-6小時(shí)（圖3.3a）。交聯(lián)后6h和8h清除ROS時(shí)可減少NF-κB通路和Akt的激活，但2 h內(nèi)同樣處理無(wú)法限制該有的激活。此外，清除交聯(lián)后3h產(chǎn)生的ROS幾乎完全抑制B細(xì)胞的增殖，清晰地表明BCR交聯(lián)誘導(dǎo)的B細(xì)胞活化依賴ROS長(zhǎng)時(shí)程產(chǎn)生。當(dāng)然，不排除是因?yàn)樵缙赗OS的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于后期，導(dǎo)致實(shí)際是后一階段ROS的產(chǎn)生調(diào)節(jié)了BCR信號(hào)。

與Wheeler和DeFranco等人(2012)的研究不同，我們認(rèn)為NOXes在BCR交聯(lián)后持續(xù)的ROS產(chǎn)生中發(fā)揮核心作用(Feng et al. 2019)。雖然B細(xì)胞主要表達(dá)NOX2，但我們發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞也表達(dá)其他NOXes亞型，例如NOX1、NOX3和DUOX2，同時(shí)這些分子對(duì)于伴侶蛋白活性的發(fā)揮十分關(guān)鍵。譬如，缺乏激活DUOX1和DUOX2所需的DUOXA1和DUOXA2的B細(xì)胞，其BCR交聯(lián)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生幾乎不變，提示DUOX1和DUOX2對(duì)于長(zhǎng)時(shí)程ROS產(chǎn)生的影響幾乎能夠忽略。相比之下，對(duì)于缺失編碼NOX1-4激活所需p22Phox的Cyba基因的B淋巴瘤細(xì)胞株BAL17，BCR交聯(lián)誘導(dǎo)的長(zhǎng)時(shí)程ROS產(chǎn)生顯著減少，結(jié)合NOX2敲除小鼠脾B細(xì)胞在BCR交聯(lián)后ROS持續(xù)產(chǎn)生恒定，故能暫且排除NOX2的影響（圖3.3a）。基于此，我們利用NOX1或NOX3缺失的BAL17細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，實(shí)際僅當(dāng)缺乏NOX3而非NOX1時(shí)，BCR交聯(lián)后ROS的持續(xù)產(chǎn)生才發(fā)生顯著減少，表明NOX3在BCR交聯(lián)誘導(dǎo)的ROS長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生中起核心作用（圖3.3b和c）。綜上，NOX3可能通過(guò)在BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的晚期產(chǎn)生ROS，于B細(xì)胞活化過(guò)程中扮演重要角色。

目前有關(guān)ROS在BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用的研究還很不多，甚至已有的文章還可能存在某些爭(zhēng)議。盡管如此，現(xiàn)在很清楚的是，ROS在BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用。NOX2在BCR交聯(lián)后能立即產(chǎn)生ROS，但早期生成的ROS可能由于含量有限，不會(huì)調(diào)控BCR信號(hào)(Richards And Clark 2009)。相反，后期誘導(dǎo)更高水平的ROS產(chǎn)生，是影響B(tài)CR信號(hào)繼而激活B細(xì)胞所必需的(Feng et al. 2019)。我們最近的結(jié)果表明，ROS的持續(xù)產(chǎn)生與NOX3有關(guān)(Feng et al. 2019)。因此猜測(cè)，BCR交聯(lián)后依次激活NOX2和NOX3，對(duì)應(yīng)早期和后期ROS的形成，盡管其中時(shí)序調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳中NOX3表達(dá)高，且與加速度和重力感知息息相關(guān)(Bedard and Krause 2007)。雖然NOX3在B細(xì)胞中的含量普遍較低，但低水平的表達(dá)可能足以調(diào)節(jié)BCR信號(hào)。事實(shí)上已經(jīng)證實(shí)，低水平表達(dá)的NOXes在諸如心血管系統(tǒng)的關(guān)鍵臟器中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Gimenez et al. 2016)。機(jī)制角度，NOX3產(chǎn)生的ROS會(huì)氧化磷酸酶等信號(hào)分子使其失活，從而增強(qiáng)BCR信號(hào)。盡管在氧化還原體中NOX催化生成的ROS可增強(qiáng)細(xì)胞因子信號(hào)，但氧化還原體在早期內(nèi)體中是瞬時(shí)產(chǎn)生的(Tsutsumi et al. 2017; Spencer and Engelhardt 2014)，目前尚不清楚是否存在更穩(wěn)定的氧化還原體以干預(yù)BCR信號(hào)。有關(guān)BCR交聯(lián)如何誘導(dǎo)NOX2和NOX3依次活化，以及NOX3介導(dǎo)的ROS如何增強(qiáng)BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等問(wèn)題仍待闡明。

SuppInfo:

DCFDA: 2’,7’–dichlorofluorescin diacetate

HVCN1: hydrogen voltage-gated channel 1