離子通道是由細(xì)胞膜上的跨膜蛋白組成的親水性蛋白質(zhì)微孔道，其可以調(diào)節(jié)膜內(nèi)外的離子濃度差，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。例如，一些離子通道控制著細(xì)胞膜內(nèi)外的離子濃度差，以此調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)、心肌收縮等。另外也有分布在細(xì)胞器膜上的離子通道，這些通道在溶酶體、線粒體膜上，能夠控制細(xì)胞代謝等功能。[1]

離子通道在人體中發(fā)揮著重要作用，且易受到藥物干預(yù)，是目前藥物開發(fā)的重要靶標(biāo)。如今，離子通道靶向藥被廣泛用于治療心律失常、高血壓、局部麻醉、疼痛、中風(fēng)、癲癇、抑郁、躁郁癥、囊腫性纖維化、心律失常、COPD、自身免疫疾病和糖尿病等一系列疾病。[2]???目前很多關(guān)于離子通道的研究，都是基于動(dòng)物水平進(jìn)行的。但是，其中一部分已經(jīng)研究透徹的離子通道相關(guān)課題，完全可以利用基因敲除細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，能夠高效的得出可靠結(jié)論。比如，當(dāng)探索離子通道在面對某些應(yīng)激情況的作用時(shí)，細(xì)胞系便能夠給予研究者造模的空間。研究者能夠利用敲除的細(xì)胞系進(jìn)行應(yīng)激造模實(shí)驗(yàn)，然后通過與wt細(xì)胞作對比，觀察敲除離子通道之后細(xì)胞的活力或細(xì)胞內(nèi)離子濃度，以此推斷離子通道對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要性。此外，離子通道敲除細(xì)胞系更重要的作用是對藥物進(jìn)行大規(guī)模的篩查分類。利用特定離子通道的敲除細(xì)胞，我們能快速判斷藥物的作用位點(diǎn)，快速并且可靠地分類出能夠影響離子通道活性和不影響離子通道活性的藥物。當(dāng)然，在研究離子通道機(jī)制時(shí)，敲除細(xì)胞系也是一種可靠的實(shí)驗(yàn)工具。

?????下面我將給大家介紹幾篇利用離子通道相關(guān)基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的研究實(shí)例。?

1.?敲除TRPV4可阻止IL8的表達(dá)水平，挽救拉伸引起的腰痛

第一篇“Identification of the TRPV4 ion channel as a mechanotransducer and therapeutic target in low back pain”是鑒定TRPV4離子通道作為腰痛的機(jī)械傳感器和治療靶點(diǎn)的研究。[3]作為一種跨膜蛋白的TRPV4，屬于transient receptor potential Vanilloid(TRPV)家族。它可以對溫度、化學(xué)物質(zhì)和機(jī)械刺激做出反應(yīng)，并在多種細(xì)胞和組織中表達(dá)。除此以外，TRPV4?還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，并參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞膜電位調(diào)節(jié)和血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)等過程。作者利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建TRPV4敲除AF細(xì)胞系，研究了基因的表達(dá)、炎癥介質(zhì)的釋放和MAPK途徑的激活。結(jié)果顯示敲除TRPV4能阻止拉伸誘導(dǎo)的IL8和IL6基因的表達(dá)。由此，作者為TRPV4在人AF細(xì)胞中可能是通過p38傳遞超生理機(jī)械信號到炎癥信號提供了新的證據(jù)。而藥理抑制或基因編輯靶向TRPV4可作為解決成纖維細(xì)胞損傷病人的椎間盤源性腰痛的潛在治療策略。

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2.?通過敲除KV1.3，研究了Loureirin B對Ca2+流入和細(xì)胞因子分泌影的作用

第二篇“Loureirin B exerts its immunosuppressive effects by inhibiting STIM1/Orai1 and KV?1.3 channels”?[4]通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除KV1.3離子通道（KCNA3基因），探索了一種離子通道干預(yù)藥物L(fēng)oureirin B（龍血素B）對Ca2+流入和細(xì)胞因子分泌的影響。在免疫系統(tǒng)中，作為主要存在于T細(xì)胞膜上的鉀離子通道，KV1.3通道可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化狀態(tài)，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在Jurkat細(xì)胞中敲除KV1.3會(huì)降低Ca2+流入和IL-2分泌，但不會(huì)消除Loureirin B對其影響。

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在實(shí)驗(yàn)中，研究人員進(jìn)一步證明Loureirin B可以通過抑制STIM1/Orai1來減少Ca2+流入和IL-2分泌。這些發(fā)現(xiàn)表明，LrB通過抑制KV1.3和STIM1/Orai1渠道來實(shí)現(xiàn)免疫抑制作用。

3.?CFTR敲除細(xì)胞驗(yàn)證CFTR通道在骨細(xì)胞中的Cl-外排介導(dǎo)作用

???????CFTR是一種調(diào)節(jié)上皮組織中電解質(zhì)和水轉(zhuǎn)運(yùn)的陰離子通道，其突變易引起囊性纖維化病變。先前有研究表明CFTR還與機(jī)械敏感有關(guān)，就此“Channel function of CFTR in bone cells for microenvironment homeostasis”5研究了CFTR在骨細(xì)胞中的功能，揭示了CFTR對骨細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)節(jié)機(jī)制，為骨細(xì)胞相關(guān)疾病的治療提供了新策略。

???????研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)MLO-Y4細(xì)胞經(jīng)CFTR抑制劑處理后胞內(nèi)Cl-濃度和去極化膜電位會(huì)增加，他們猜測CFTR或許介導(dǎo)了骨細(xì)胞中的Cl-外排。他們利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建出了CFTR敲除MLO-Y4細(xì)胞系。對CFTR基因敲除細(xì)胞系進(jìn)行抑制劑處理后，檢測胞內(nèi)Cl-濃度和膜電位，發(fā)現(xiàn)CFTR基因敲除細(xì)胞系胞內(nèi)Cl-濃度和膜電位的增加更大，證實(shí)了CFTR介導(dǎo)骨細(xì)胞中的Cl-外排。此外，通過比較CFTR敲除前后MLO-Y4細(xì)胞堿化后胞內(nèi)pH恢復(fù)速率發(fā)現(xiàn)，CFTR能促進(jìn)細(xì)胞分泌HCO3-，提示CFTR通過介導(dǎo)HCO3-外排調(diào)節(jié)骨細(xì)胞中的pH，為全身性酸中毒引起的pH變化導(dǎo)致的嚴(yán)重骨質(zhì)疏松癥、骨軟化癥治療提供理論基礎(chǔ)。

以上是近兩年來發(fā)表的應(yīng)用離子通道敲除細(xì)胞系進(jìn)行藥物干預(yù)機(jī)制、離子通道作用機(jī)制研究的3篇文章。當(dāng)研究未知離子通道時(shí)，研究者不確定敲除通道基因后是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間互作改變，會(huì)愿意花費(fèi)漫長時(shí)間構(gòu)建動(dòng)物模型。?

???????但是，對于已經(jīng)被大家熟知的離子通道，我們便沒有必要等待漫長的動(dòng)物模型構(gòu)建的周期。我們可以利用CRISPR/Cas9技術(shù)直接在目標(biāo)細(xì)胞系上敲除或敲入離子通道，進(jìn)行細(xì)胞層面實(shí)驗(yàn)。特別是一些需要長時(shí)程檢測離子通道活性的實(shí)驗(yàn)，離子通道敲除細(xì)胞系更能成為比較理想的實(shí)驗(yàn)材料。若采用動(dòng)物模型，我們需要對離體組織進(jìn)行離子通道的活性檢測，即使將生命力較為頑強(qiáng)的腦組織放入維持液中，其理想的檢測窗口也只能延長到4小時(shí)，更不用說那些更加脆弱的心肌組織。

此外，離子通道敲除細(xì)胞系是對治療藥物進(jìn)行初期篩選最好的工具。簡要來說，其有兩種優(yōu)勢，第一是細(xì)胞具有良好的穩(wěn)定性，并且重復(fù)性高，相較于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成本更低，實(shí)驗(yàn)周期更短。另外一點(diǎn)就是，進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們可以把人類的腫瘤細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)工具，這樣便可以保證離子通道的蛋白結(jié)構(gòu)的同源性，為藥物篩選的結(jié)果提高可信度。

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參考文獻(xiàn)：

[1]?Ohya, S., Kito, H., Hatano, N. & Muraki, K. Recent advances in therapeutic strategies that focus on the regulation of ion channel expression.?Pharmacol Ther?160, 11-43, doi:10.1016/j.pharmthera.2016.02.001 (2016).

[2]?Boyden, P. A. & Jeck, C. D. Ion channel function in disease.?Cardiovasc Res?29, 312-318 (1995).

[3]?Cambria, E.?Identification of the TRPV4 ion channel as a mechanotransducer and therapeutic target in low back pain, ETH Zurich, (2021).

[4]?Shi, S.?et al.?Loureirin B Exerts its Immunosuppressive Effects by Inhibiting STIM1/Orai1 and KV1. 3 Channels.?Frontiers in Pharmacology?12, 1298 (2021).

[5]?Zhang, X. Channel function of CFTR in bone cells for microenvironment homeostasis.?(2022).