優(yōu)勢

• 相比傳統(tǒng)方法，能夠篩選更多克隆，增加發(fā)現(xiàn)稀有、高產(chǎn)分泌子的可能性

• 獨特的流程生產(chǎn)高滴度的雜交瘤細(xì)胞

• 增加發(fā)現(xiàn)最優(yōu)細(xì)胞生產(chǎn)器的可能性

雙鏈 DNA 病毒引起人類大多數(shù)疾病。皰疹病毒和腺病毒家族和乳頭瘤 病毒在人體中會產(chǎn)生相似的癥狀。而且，由于病毒抗原基因組的保守，對 于特殊病毒的血清學(xué)和蛋白診斷確認(rèn)是非常復(fù)雜的。高度的蛋白同源性和血清交叉反應(yīng)導(dǎo)致雙鏈 DNA 病毒物種之間區(qū)分是非常困難的。本研究的目的是發(fā)現(xiàn)識別最優(yōu)的分泌高度特異性、無交叉反應(yīng)的單克隆抗體的細(xì)胞系， 用于生物治療的開發(fā)。 ClonePix 系統(tǒng)用來高通量從母本的雜交瘤細(xì)胞中（歷史數(shù)據(jù)表明母本的 細(xì)胞系產(chǎn)量少于 1mg/L 的單抗）篩選數(shù)以百計的亞克隆。分泌高 IgG的活細(xì)胞進(jìn)一步用客觀評價細(xì)胞生長的 CloneSelect Imager 系統(tǒng)來評估。高效自動化克隆選擇技術(shù)旨在挽回高滴度的雜交瘤細(xì)胞系，這些細(xì)胞系能生產(chǎn)抗原高特異性的抗體。ClonePix 和 CloneSelect Imager 配套技術(shù)為免疫診斷技術(shù)發(fā)展提供了足夠的病毒抗原的特異性抗體。

材料

• ClonePix System (Molecular Devices, LLC)

• CloneSelect Imager (Molecular Devices, LLC)

• CloneMedia Semi-Solid Media for hybridomas/myelomas (Molecular Devices, LLC Cat #K8600/K8610)

• CloneDetect Reagent, Mouse IgG (H+L) Specific,Fluorescein (Molecular Devices, LLC Cat #K8220)

挽救低產(chǎn)量的雜交瘤細(xì)胞

傳統(tǒng)雜交瘤開發(fā)的方法涉及骨髓瘤細(xì)胞和抗原免疫過的宿主脾細(xì)胞的化學(xué)介導(dǎo)融合過程。融合的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)歷了眾所周知漫長和低效率的有限稀釋法的選擇過程，接著用 ELISA方法篩選分離出有限數(shù)目的抗原特異性單克隆雜交瘤細(xì)胞。太長的時間戰(zhàn)線（超過30 周）和大量的處理過程，使有限稀釋法產(chǎn)生不能準(zhǔn)確量化活性和生產(chǎn)力的低滴度細(xì)胞系。 最早的雙鏈DNA 病毒特異性雜交瘤細(xì)胞系是1990s用有限稀釋方法開發(fā)的，但是篩選的雜交瘤細(xì)胞單克隆性和穩(wěn)定性都不是很好。用不同的血清和培養(yǎng)基組分進(jìn)行多年的重復(fù)培養(yǎng)（靜態(tài)的和旋轉(zhuǎn)的），這些克隆表現(xiàn)出不穩(wěn)定（圖1）。而且，抗體的產(chǎn)率從來沒有超過 3mg/L。由于在preps中能觀察的差別巨大的聚集物，使得純化的IgG的質(zhì)量很難保持一致性。

通過亞克隆高滴度抗體的親本細(xì)胞系，挽回和穩(wěn)定特異性的雜交瘤細(xì)胞系。ClonePix 技術(shù)平臺利用半固體培養(yǎng)基和CloneDetect無標(biāo)記檢測技術(shù)重篩了大量以前融合的雜交瘤細(xì) 胞（圖2），顯示了明顯的技術(shù)優(yōu)勢。

ClonePix高通量篩選方法能夠從低產(chǎn)的親本克隆細(xì)胞中挽回高產(chǎn)、穩(wěn)定的細(xì)胞。

快速分離分泌抗體的高產(chǎn)克隆

ClonePix系統(tǒng)在流程效率和成本節(jié)約方面顯示了顯著改善，增加了發(fā)現(xiàn)稀有分泌子的 概率。因此，ClonePix2技術(shù)單克隆抗體產(chǎn)生的時間減少到有限稀釋法的一半。 在這個過程中，首先擴增親本雜交瘤克隆的數(shù)量，然后 ClonePix 分析和挑選想要的克隆。 配合使用 FITC 標(biāo)記的 CloneDetect 試劑，ClonePix 系統(tǒng)成像和分析熒光強度。FITC 陽性克隆 根據(jù)克隆外部平均熒光強度由高到低進(jìn)行排序?？傊?，僅僅 5-6%的 480-FITC 的陽性克隆被 挑取。相比大的、快速生長的陰性克?。?0-150 個細(xì)胞）（圖 3），大多數(shù)高分泌的克隆更小 （40-60 個細(xì)胞）。

480 個高產(chǎn)克隆從半固體培養(yǎng)基挑取到 5 塊 96 孔含 200-μL 液體培養(yǎng)基的微孔板中，培 養(yǎng) 3 天。為了客觀和定量評估細(xì)胞數(shù)，使用 CloneSelect Imager 系統(tǒng)成像 96 孔板中的克隆。 超快的成像速度（96 孔板小于 90sec）能夠快速監(jiān)控和評估 5 天克隆的生長。通過有效的利 用 CloneSelect Imager 的成像，分離到前 146 個生長速度快的克?。▓D 4）。

篩選和識別中試規(guī)模分析的亞克隆

用合成的具有抗體表位的多肽，對篩選到的前 146 生長速率的克隆進(jìn)行抗原特異性分析。

多肽和抗體顯示了很強的的親和性，完全符合前期研究的闡釋，因此，合成的多肽用來篩選新的，具有高抗體親和性的亞克隆。

生物素標(biāo)記的多肽加載在含鏈霉素的微孔板表面，再加 146 個沒有稀釋的雜交瘤細(xì)胞上清液，測定 IgG 的結(jié)合能力。從中選取了前 7 個顯示了最優(yōu)結(jié)合力的特殊亞克隆。

高?IgG?分泌亞克隆的中試規(guī)模生產(chǎn)

7 個高價值特異的亞克隆在液體培養(yǎng)基規(guī)?；a(chǎn)。這些克隆被擴增，一旦獲得足夠的培養(yǎng)基體積，5 個亞克隆被冷凍用于將來的研究參考。而剩下的 2 個高親和/高 IgG 分泌克隆繼續(xù)擴增 2-3 周，直到完成中試生產(chǎn)（1 升）

挽救低產(chǎn)量雜交瘤細(xì)胞的工作流程

為了識別用于發(fā)展高級診斷的雙鏈 DNA 病毒特異抗體的亞克隆，ClonePix 技術(shù)篩選 480FITC 陽性的雜交瘤克隆，基于半固體培養(yǎng)基技術(shù)和 FITC 標(biāo)記的 CloneDetect 試劑。?CloneSelect Imager細(xì)胞生長分析識別了其中 146 個快速生產(chǎn)的克隆，7 個高產(chǎn)量的克隆被確認(rèn)和目標(biāo)多肽具有高度的特異性。選擇其中的 2 個亞克隆進(jìn)行中試生產(chǎn)和剩余的 5 個作為細(xì)胞銀行。這個流程降低了雜交瘤細(xì)胞的篩選時間，最多為常規(guī)有限稀釋法篩選時間的 50%，而且篩選了強健的目標(biāo)克隆細(xì)胞作為其他附加的研究和生產(chǎn)。

單克隆的驗證和?IgG?分泌子的均一化

ClonePix 系統(tǒng)再克隆和特異性確認(rèn)之后，2 個亞克隆擴增，重新種到具有 CloneDetect 試劑的半固體培養(yǎng)基的 6 孔板中。ClonePix 系統(tǒng)成像和分析表明克隆正常的分泌了 IgG，同時，通過均相均一化過程，能觀察到高產(chǎn) IgG 的克隆（圖 5）。

新雙鏈?DNA?病毒雜交瘤細(xì)胞亞克隆的生產(chǎn)能力

利用 ClonePix 技術(shù)重新篩選低產(chǎn)量的親本克隆。高產(chǎn)、穩(wěn)定的亞克隆被挽回。Protein G 純化單克隆抗體，定量總產(chǎn)量。相比親本克隆的歷史產(chǎn)量（~1mg/L），新的亞克隆細(xì)胞 IgG 的產(chǎn)量明顯地增加（17-25mg/L），圖 6 顯示。

結(jié)論

ClonePix 技術(shù)改善了篩選時間周期和亞克隆雜交瘤細(xì)胞的質(zhì)量，降低手動操作。而且，

CloneMatrix Media 和 CloneDetect 試劑提高了分泌克隆的生長和檢測靈敏度。ClonePix 的數(shù)據(jù)表明親本的低生產(chǎn)力源于小數(shù)目生產(chǎn)抗體的細(xì)胞被快速、無生產(chǎn)抗體能力的細(xì)胞壓制。

相比親本雜交瘤細(xì)胞的產(chǎn)量（05-1mg/L）， 結(jié)合 CloneSelect Imager 的使用，ClonePix 系統(tǒng)被證明是能識別高產(chǎn)（17-25mg/L）、高親和力雜交瘤細(xì)胞亞克隆的強有力工具。因此，該技術(shù)有助于推進(jìn)雙鏈 DNA 病毒特異性的新治療性抗體的發(fā)展。

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