1、堿裂解所需試劑及各自作用

?1.(單選題，10 分) 堿裂解法提細菌質(zhì)粒 solution I 說法錯誤的是：

A.葡糖糖的作用是防止細菌快速沉淀?

B.Tris 的作用是提供適當?shù)?pH 緩沖體系

C.EDTA 是為了去除二價金屬離子，抑制核酸酶活性

D.solution I 要現(xiàn)用現(xiàn)配?

答案解析：選擇、判斷、堿裂解所需試劑及各自作用（簡答）

2.(單選題，10 分) 堿裂解法提細菌質(zhì)粒 solution II 說法錯誤的是：

A.solution II 配置好以后要低溫儲存?

B.氫氧化鈉的作用是讓蛋白質(zhì)和 DNA 變性

C.SDS 的作用是溶解細胞膜并與蛋白結(jié)合，為下一步沉淀做準備

D.操作要快且溫和，防止 DNA 斷裂?

答案解析：選擇、判斷、堿裂解所需試劑及各自作用（簡答）

3.(單選題，10 分) 堿裂解法提細菌質(zhì)粒 solution III 說法錯誤的是：

A.醋酸是為了中和堿性

B.醋酸-醋酸鉀是為了提供緩沖液體系

C.鉀離子可以和 SDS 反應生成不溶物?

D.PDS-組蛋白-基因組可以一起從水溶液中去除

答案解析：選擇、判斷、堿裂解所需試劑及各自作用（簡答）

4.(單選題，10 分) 堿裂解法提細菌質(zhì)粒一些其他試劑說法錯誤的是：

A.溶菌酶可以用于水解細菌細胞壁?

B.DNA 不溶于乙醇，可以利用乙醇沉淀?

C.氯仿可以搶奪蛋白表面水分子，使蛋白質(zhì)變性析出

D.異戊醇有助于消除氣泡和維持相的穩(wěn)定?

答案解析：選擇、判斷、堿裂解所需試劑及各自作用（簡答）

2、藍白斑篩選的基本原理（α互補）

? 在篩選平板上接種轉(zhuǎn)化后大腸桿菌，長出的藍色菌落是不含目的基因、轉(zhuǎn)化成功的大腸 桿菌。白色菌落是含目的基因的、轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌。而沒有成功轉(zhuǎn)化任何一種質(zhì)粒 的大腸桿菌，會因不攜帶抗性基因無法在篩選平板上存活。 藍白斑產(chǎn)生的原理是：大腸桿菌天生能生成β-半乳糖苷酶，轉(zhuǎn)化 X-Gal 為藍色可溶性物 質(zhì)，使得菌落呈藍色。 但用于藍白斑篩選的大腸桿菌是β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。需要質(zhì)粒、大腸桿菌二者共 同的產(chǎn)物，才能生成β-半乳糖苷酶。但質(zhì)粒與β-半乳糖苷酶相關(guān)的基因上，有目的基因 插入的多克隆位點。因此，但載體與目的基因正確結(jié)合，β-半乳糖苷酶也無法正常生成。 根據(jù)這樣的原理，我們可以根據(jù)藍白斑區(qū)分轉(zhuǎn)化成功、含正確重組質(zhì)粒的菌落。?

3、氯化鈣轉(zhuǎn)化法/凍融轉(zhuǎn)化法/熱激轉(zhuǎn)化法的原理?

利用鈣離子中和 DNA 分子和細胞膜所帶負電荷（降低雙電層厚度），并利用低溫低滲 的氯化鈣溶液，讓細胞處于球形（比表面積最大），從而吸附更多 DNA，即該狀態(tài)下 細胞處于感受態(tài)。瞬時加熱處理（熱激）可以導致細胞膜快速膨脹出現(xiàn)縫隙，從而使細 胞表面吸附的 DNA 進入細胞，完成轉(zhuǎn)化。因關(guān)鍵試劑是氯化鈣，所以稱氯化鈣法；又 因有熱激這一關(guān)鍵操作，也稱熱激法；又因感受態(tài)細胞儲存時處于冷凍環(huán)境，使用時融 化，又稱凍融法。?

4、基因工程中，對于轉(zhuǎn)化子的初篩、復篩各有哪些原則，可以分別用什么實驗 方法達到目的? 初篩——排除無載體宿主細胞——抗性基因、營養(yǎng)缺陷型?

初篩——排除空載體轉(zhuǎn)化子——雙抗平板對比生長（影印法）、藍白斑篩選、以赭石突 變?yōu)榛A(chǔ)的顏色變化（酵母）、以琥珀突變?yōu)榛A(chǔ)的顏色變化（酵母）、植物報告基因 篩選（GUS、GFP）?

驗證初篩結(jié)果——基于電泳的初步檢測——提取原始/重組質(zhì)粒比較大小、酶切原始/重 組質(zhì)粒比較大小上的差別、對目的基因進行 PCR

驗證初篩結(jié)果——基于雜交的進一步檢測——利用 DNA 或 RNA 探針進行雜交驗證、菌 落原位雜交

驗證初篩結(jié)果——決定性證據(jù)——測序 復篩——基于實驗目的的優(yōu)選——直接利用實驗目的篩選

復篩——目標蛋白是否存在的初步判斷——蛋白電泳觀察是否出現(xiàn)新條帶或者目標位 置蛋白是否濃度提高顯著?

復篩——目標蛋白是否正確——western blot、菌落原位雜交、蛋白質(zhì)譜?

5、“轉(zhuǎn)化”的基本過程 轉(zhuǎn)化的基本過程：

（1）供體菌 dsDNA?段與感受態(tài)體菌細胞表?的膜連 DNA 結(jié)合蛋 ?相結(jié)合,其中?條鏈被核酸酶切開和?解,;另?條進?細胞。

（2）來?供體菌的 ssDNA ?段被細胞內(nèi)的感受態(tài)特異的ssDNA結(jié)合蛋?相結(jié)合,并使ssDNA結(jié)合蛋?相結(jié)合,并且 使 ssDNA 進?細胞,隨即在 RecA 蛋?的介導下與受體菌核染?體上的同源區(qū)段配對,重 組,形成??段雜合 DNA 區(qū)段。

（3）受體菌染?體組進?復制,于是雜合區(qū)也跟著得到 復制。

（4）細胞分裂后,形成?個轉(zhuǎn)化?和?個仍保持受體菌原來基因型的?代。

5、A-T 克隆的優(yōu)缺點?

優(yōu)點：

（1）AT 克隆可以利用 Taq 酶在基因兩端添加的單個脫氧核糖核苷酸 A 與線性載 體兩端的單個脫氧核糖核苷酸 T 的互補配對完成快速的載體構(gòu)建。?

（2）AT 克隆可以將目的基因的插入位點放置在 LacZ’基因內(nèi)部，從而利用藍白斑篩選 快速完成陽性克隆篩選，可以避免載體自連帶來的干擾。

?缺點：

（1）AT 克隆不能規(guī)定目的基因在載體上的插入方向。

（2）AT 克隆不能避免載 體自連。?

6、定向克隆的優(yōu)缺點?

優(yōu)點：

（1）可避免載體和基因的自身環(huán)化。

（2）固定了基因在載體上的插入方向。

缺點：

（1）酶切位點不易找到。

（2）多體系完成（酶切載體、酶切目的基因、連接切 好的載體和基因）。

（3）酶切產(chǎn)物需要純化才能進行連接，增加了實驗的復雜性（內(nèi) 切酶只切割 DNA 磷酸二酯鍵，不純化切下的 DNA 單鏈會粘附在粘性末端，從而降低雜 合 DNA 分子的數(shù)量）

7、單酶切/平末端酶切載體構(gòu)建法的優(yōu)缺點

優(yōu)點：

（1）酶切位點易選澤

（2）平末端目的基因基本無需改造（單酶切需要改造，添 加酶切位點）。

（3）酶切后載體、基因無需純化即可進行連接操作?

缺點：

（1）目的基因、載體自身環(huán)化和線性化連接概率高

（2）連接效率低（酶和底物 隨機碰撞概率低）

8、去磷酸化克隆法的優(yōu)缺點?

優(yōu)點：

（1）排除了載體自連的可能性，提高了雜合重組率

（2）降低了基因線性聚合的 概率，平板上生長的含雜合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子概率高（目的基因自連成環(huán)的不能復制）?

缺點：

（1）去磷酸化不能固定基因插入方向，可能有反向插入

（2）增加了去磷酸化這 一步驟，可能降低成功率

（3）只能選擇去磷酸化載體和基因中的一個（另一個需要保 留磷酸基團用于連接），通常選擇去磷酸化載體，導致目的基因仍有環(huán)化可能性，降低 了連接效率。

9、無縫克隆的優(yōu)缺點?

優(yōu)點：

（1）基因插入位點選擇靈活，不受酶切位點限制。

（2）省略酶切、切膠、連接 過程，反應單體系完成，操作快捷。

（3）基因以固定方向插入載體。

（4）多片段連接 效率高。 缺點：通常需要商品化試劑盒，成本高。

10、物質(zhì)的污染 衡量所提取 DNA 的純度可用 OD260 與 OD280 的比值,OD260/OD280 對 DNA 而言其值 大約為 1.8，那么當 OD260/OD280 大于 1.9 則可能有（ RNA ）污染，當 OD260/ OD280 小于 1.6 時則有（ 蛋白質(zhì) ）污染，同理，對 RNA 而言 OD260/OD280 值 大約為 2.0，當 OD260/OD280 大于 2.1 則可能有（ 異硫氰酸胍 ）污染，當 OD260/ OD280 小于 1.9 時則有（ DNA ）污染。

8.(單選題，10 分) 關(guān)于雙脫氧測序和 DNA 復制的異同，描述錯誤的是：

A.雙脫氧測序和 DNA 復制用的都是 DNA 聚合酶

B.雙脫氧測序和 DNA 復制都需要引物

C.雙脫氧測序和 DNA 復制都必須有變性-退火-延伸三個步驟的多次循環(huán)

D.雙脫氧測序和 DNA 復制的主要差異之一在前者的反應底物是 dNTP 和四種 ddNTP， 而后者只需要 dNTP?