神經(jīng)系統(tǒng)分為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system, CNS）和外周神經(jīng)系統(tǒng)（Peripheral nervous system，PNS）。中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括腦和脊髓，分別位于顱腔和椎管內(nèi)，是神經(jīng)系統(tǒng)的主要部分，外周神經(jīng)系統(tǒng)包括與腦相連的腦神經(jīng)（cranial?nerves）和與脊髓相連的脊神經(jīng)（spinal?nerves）。隨著研究的深入，人們對神經(jīng)系統(tǒng)功能已經(jīng)有了更近一步的認(rèn)識，但由于神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性、組織再生能力的有限性以及血腦屏障對藥物傳送的阻隔，使用傳統(tǒng)藥物和外科手術(shù)方法治療神經(jīng)系統(tǒng)類疾病仍困難重重。

圖1. 人腦解剖圖

目前，基因療法已被應(yīng)用于多種疾病的治療，利用病毒載體將遺傳物質(zhì)傳遞到器官周圍，并在靶細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)特異表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因治療。在神經(jīng)科學(xué)研究中，尤其是在體實(shí)驗(yàn)，通常利用腺相關(guān)病毒工具載體研究基因的功能作用，那么如何才能更高效地利用AAV在神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)呢？今天我們就一起學(xué)習(xí)AAV在神經(jīng)研究中的選擇策略。

一、AAV血清型的選擇

據(jù)報(bào)道，目前適用于神經(jīng)系統(tǒng)的AAV血清型有：1、2、5、6、8、9、PHP.B、PHP.eB、PHP.S、DJ、Retro、rh10等十幾種，不同的血清型在神經(jīng)系統(tǒng)不同部位的感染效率及擴(kuò)散能力不同，合適的血清型關(guān)乎基因是否能夠?qū)崿F(xiàn)高效穩(wěn)定表達(dá)，甚至關(guān)乎最終的研究結(jié)果，因此綜合標(biāo)記的細(xì)胞和每種AAV血清型的特性等因素來選擇合適的AAV血清型至關(guān)重要。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，AAV1,2和5在CNS轉(zhuǎn)導(dǎo)水平有限，且表現(xiàn)出不同的細(xì)胞特異性，如AAV1和5能轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，而AAV2只能轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元。AAV9在CNS中的應(yīng)用則較為廣泛，具有強(qiáng)的擴(kuò)散性，且能穿過血腦屏障（BBB）實(shí)現(xiàn)基因高表達(dá)。而在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，AAV9、rh10、PHP.S的感染效果較好。

接下來，就來詳細(xì)介紹一下在神經(jīng)環(huán)路示蹤中幾種常用的AAV血清型：

01?可逆向示蹤的血清型— AAV2-retro

常見的AAV病毒載體都是順向標(biāo)記，極少能進(jìn)行逆行傳遞，這大大限制了AAV載體在神經(jīng)環(huán)路示蹤中的應(yīng)用。直到2016年，研究人員在AAV2的基礎(chǔ)上，通過定向進(jìn)化的方式改造出一種具有逆向示蹤功能的AAV2突變體——AAV2-retro，該載體能夠在小鼠大腦中進(jìn)行有效的神經(jīng)環(huán)路逆向標(biāo)記，且其逆行示蹤能力和效率與傳統(tǒng)的逆行示蹤劑相當(dāng)。圖2所示為rAAV2-retro的開發(fā)過程及應(yīng)用實(shí)例：

圖2. rAAV2-retro（逆向非跨突觸標(biāo)記）（Tervo et al., Neuron, 2016）

02?可順向跨單級突觸的血清型 — AAV1

2017年張礪教授團(tuán)隊(duì)研究報(bào)道AAV1能在高滴度條件下呈順向跨突觸傳播，與Cre依賴的報(bào)告系統(tǒng)相結(jié)合，可高效和特異性地驅(qū)動Cre依賴的外源基因在突觸后神經(jīng)元中的表達(dá)，以標(biāo)記突觸后神經(jīng)元。2020年該研究團(tuán)隊(duì)再次深入研究了AAV1順向跨突觸標(biāo)記的作用機(jī)制——依賴于突觸囊泡的釋放，同時揭示了其在多種神經(jīng)環(huán)路中的廣泛應(yīng)用，為AAV1作為順向跨突觸示蹤病毒工具對神經(jīng)元及其投射腦區(qū)進(jìn)行標(biāo)記提供了諸多證據(jù)，如圖3所示。

?圖3. AAV1順向跨突觸標(biāo)記（Zingg B et al., J Neurosci, 2020）

此外，張礪教授團(tuán)隊(duì)還證實(shí)scAAV1-hSyn-Cre相比AAV1載體具有更優(yōu)越的順向跨突觸標(biāo)記能力，可在興奮性、抑制性、神經(jīng)調(diào)質(zhì)和腦-脊髓等多種神經(jīng)環(huán)路中有效、特異地標(biāo)記單突觸靶神經(jīng)元及其輸出，從而解析不同的功能/行為。

03?可跨血腦屏障的血清型 — AAV9、AAVPHP.B、AAVPHP.eB、AAVPHP.S、AAV.CPP.16

血腦屏障的存在對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有很強(qiáng)的保護(hù)作用，但同時它也能阻隔藥物的傳遞和吸收，使神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療變得異常困難，研究人員通過進(jìn)一步改造AAV衣殼，發(fā)現(xiàn)AAV9& AAVPHP.B&AAVPHP.eB&AAVPHP.S可以有效介導(dǎo)基因由外周向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的跨越，繼而將遺傳物質(zhì)遞送至大腦或脊髓中。研究結(jié)果顯示，AAV-PHP.B可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)成年小鼠大腦和脊髓的神經(jīng)元，AAV-PHP.eB降低了誘導(dǎo)大多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元所需的病毒載量，而AAV-PHP.S顯示出對周圍神經(jīng)元的更好趨向性?？傊@些AAV變體可以有效介導(dǎo)基因由外周向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的跨越，更好地應(yīng)用于神經(jīng)環(huán)路研究。

?圖4. AAV9& AAVPHP.B& AAVPHP.eB& AAVPHP.S有效介導(dǎo)基因由外周至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的跨越(Ken Y Chanet al., Nat Neurosci, 2017)

美國哈佛大學(xué)聯(lián)合武漢大學(xué)人民醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)利用合理性設(shè)計(jì)的方法，將選定的細(xì)胞穿透肽 CPP（一 組可以穿過細(xì)胞膜或組織屏障的短肽）分別插入 AAV9 衣殼（Q588 和 A589 之間）生成突變體庫， 將包裝好的 AAV 突變體通過靜脈注射至小鼠體內(nèi)，經(jīng)過序列優(yōu)化和篩選測試，得到血腦屏障穿透性顯著優(yōu)于 AAV9 的 AAV.CPP.16。通過在不同品系小鼠和食蟹猴動物模型中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)靜脈注射AAV.CPP.16 可以高效跨越血腦屏障，感染 CNS 神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及脊髓運(yùn)動神經(jīng)元。基于小鼠與食蟹猴研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)給藥 AAV.CPP.16 仍可感染肝臟、肌肉、心臟等外周臟器，但在檢查的組織中均未觀察到明顯的病理反應(yīng)，也未引起背根神經(jīng)節(jié)退化變性。重要的是，研究人員發(fā)現(xiàn)AAV.CPP.16 可用于 GBM 小鼠模型的基因治療，并具有持久高效的抗腫瘤作用。

?圖5. AAV.CPP.16 對食蟹猴的腦部轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著優(yōu)于AAV9

啟動子：CAG ??實(shí)驗(yàn)動物：新生食蟹猴(3 月齡)/ 成年食蟹猴(3-4 歲)

注射方式：靜脈注射? ?病毒用量：新生食蟹猴 2×10E13vg/kg，成年食蟹猴 5×10E13vg/kg

（Yao et al., Nat Biomed Eng, 2022）

04?可高效靶向神經(jīng)元細(xì)胞的血清型—AAV.CAP-B10

加州理工學(xué)院的 Viviana Gradinaru 團(tuán)隊(duì)通過對 AAV9 進(jìn)行衣殼改造，開發(fā)了一系列 AAV 變體，其中AAV.CAP-B10，靜脈注射后，不僅能夠突破血腦屏障，高效靶向神經(jīng)元細(xì)胞，同時不會在肝臟富集。

該研究團(tuán)隊(duì)對比了不同 AAV 血清型通過靜脈注射在各組織器官中的遞送效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AAV. CAP-B10 表現(xiàn)出對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特異性，高度靶向神經(jīng)元細(xì)胞，對肝臟具有低靶向性，這一結(jié)果不僅在小鼠上得到了證實(shí)，在非人靈長類動物狨猴上也得到了證實(shí)。這為腦研究工作者提供了新的工具策略，同時這也為腦部疾病提供了一種更安全、有效的治療選擇。

圖6. AAV.CAP-B10 高效靶向小鼠腦組織而非肝臟

啟動子：CAG ?? ?實(shí)驗(yàn)動物：雄性 C57BL/6J 小鼠?

注射方式：靜脈注射? ? ? 病毒用量：5×1011VG/mice

（David Goertsen et al., Nature Neuroscience, 2022）

圖7. 在狨猴中，AAV.CAP-B10 特異性靶向神經(jīng)元

啟動子：CAG；實(shí)驗(yàn)動物：成年狨猴；

?注射方式：靜脈注射；病毒用量：7×1013VG/KG

（David Goertsen et al., Nature Neuroscience, 2022）

05?可高效靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞的血清型—rAAV11

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的關(guān)鍵反應(yīng)細(xì)胞，在脊髓損傷的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙已被證實(shí)是腦卒中、阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病的核心特征。中科院徐富強(qiáng)團(tuán)隊(duì)對一系列工具病毒進(jìn)行改造和篩選，開發(fā)了一種新的高效逆行靶向投射神經(jīng)元的重組腺相關(guān)病毒 rAAV11。研究發(fā)現(xiàn)，rAAV11 可以高效逆行靶向投射神經(jīng)元，且不表現(xiàn)出順行跨突觸特征；rAAV11 還具備優(yōu)秀的逆行標(biāo)記效率，能示蹤 rAAV2 難以轉(zhuǎn)導(dǎo)的投射神經(jīng)元。值得注意的是，rAAV11 可以高效且特異性靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞，為星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究提供了更加有力的病毒工具。

?圖8. rAAV11 靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞

啟動子：GfaABC1D；實(shí)驗(yàn)動物：C57BL/6J 小鼠；

?注射部位：齒狀回（DG）區(qū)；病毒用量：2×109?VG/mice

（Han et al., bioRxiv preprint, 2022）

06?可高效靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的血清型—AAV-cMG & AAV-MG

北京生命科學(xué)研究所羅敏敏實(shí)驗(yàn)室通過定向進(jìn)化策略，開發(fā)了一系列能夠在體內(nèi)和體外高效侵染小膠質(zhì)細(xì)胞的新型 rAAV 載體。該研究針對 AAV9 的衣殼蛋白進(jìn)行改造，鑒定篩選出兩個衣殼蛋白（AAV-cMG. WPP 和 AAV-cMG.QRP）能夠在一定程度上提高 rAAV 病毒對體外培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的侵染效率。以此為基礎(chǔ)，研究團(tuán)隊(duì)針對 AAV-cMG.QRP 的插入肽段及其在衣殼蛋白插入位點(diǎn)的相鄰氨基酸進(jìn)行突變篩選，成功得到了高效侵染體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞的 AAV-cMG 衣殼蛋白，同時并不導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。

?圖9. 體外篩選得到 AAV-cMG

啟動子：CMV；轉(zhuǎn)染細(xì)胞：小膠質(zhì)細(xì)胞；MOI：104

（Lin et al., Nature Neuroscience, 2022）

研究人員進(jìn)一步在 AAV-cMG.WPP 基礎(chǔ)之上構(gòu)建新的 AAV 突變文庫，并在小膠質(zhì)細(xì)胞特異的 Cx3cr1-CreER 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)進(jìn)行針對性體內(nèi)篩選，成功鑒定得到 AAV-MG1.1 和 AAV-MG1.2，能夠在體內(nèi)高效侵染小膠質(zhì)細(xì)胞，且不誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫激活。

?圖10. 體內(nèi)篩選得到 AAV-MG1.1/1.2 高效轉(zhuǎn)導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞

啟動子：CMV；實(shí)驗(yàn)動物：Cx3cr1-CreER 轉(zhuǎn)基因小鼠；

注射部位：紋狀體（800nl）和中腦（500nl）；

病毒滴度：5×107?vg.μl-1

（Lin et al., Nature Neuroscience, 2022）

這兩類分別適用于體外侵染培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞（AAV-cMG）和體內(nèi)侵染內(nèi)源性小膠質(zhì)細(xì)胞（AAV-MG）的新型 rAAV 載體，將有助于小膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)及相關(guān)疾病機(jī)制的研究。

07?可高效靶向中樞血管內(nèi)皮細(xì)胞的血清型—AAV-BI30

腦血管內(nèi)皮細(xì)胞是表達(dá)在血管腔隙的一類中樞非神經(jīng)元細(xì)胞群體，作為血腦屏障的重要組成部分，參與許多關(guān)鍵的生理過程。美國麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)布羅德研究所的 Benjamin E. Deverman 組和哈佛醫(yī)學(xué)院的 ChenghuaGu組開發(fā)了一種新的血清型 AAV-BI30，可在多個鼠系體內(nèi)以及體外高效轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞。在相對較低的全身劑量下，該載體可轉(zhuǎn)導(dǎo)成年 C57BL/6 小鼠大腦、視網(wǎng)膜和脊髓血管系統(tǒng)中的大多數(shù)動脈、毛細(xì)血管和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。

?圖11. AAV-BI30 能有效地通過動靜脈軸轉(zhuǎn)導(dǎo)大腦內(nèi)皮細(xì)胞

啟動子：CAG；? 實(shí)驗(yàn)動物：成年 C57BL/6J 小鼠；

注射方式：靜脈注射；? 病毒用量：1×1011?vg/mice

（Krolak et al., NATuRE CARDIoVASCuLAR RESEARCH,2022）

?圖12. AAV-BI30 靶向視網(wǎng)膜和脊髓血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞

啟動子：CAG；實(shí)驗(yàn)動物：成年 C57BL/6J 小鼠；

注射方式：靜脈注射；病毒用量：1×1011?vg/mice

（Krolak et al., NATuRE CARDIoVASCuLAR RESEARCH, 2022）

此外，AAV-BI30 在 CNS 中能實(shí)現(xiàn)高效的 Cre 介導(dǎo)的基因操縱。AAV-BI30 能高效的在中樞不同類型血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，適用于神經(jīng)血管生物學(xué)相關(guān)研究，并有助于開發(fā)內(nèi)皮功能障礙類疾病的治療方法。

二、?AAV載體的優(yōu)化選擇（ssAAV or scAAV）

根據(jù)細(xì)胞類型與實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇好合適的血清型后，還可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行AAV載體的優(yōu)化選擇。腺相關(guān)病毒為單鏈DNA病毒（ssAAV）, 在入核、脫衣殼后，需要借助宿主DNA聚合酶或者分子間退火完成雙鏈轉(zhuǎn)化，才能啟動基因轉(zhuǎn)錄過程，這一過程限制了AAV載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，并直接影響病毒的感染效率。自身互補(bǔ)雙鏈DNA的腺相關(guān)病毒(scAAV)能夠克服這一限制，不需要經(jīng)歷一個由單鏈變?yōu)殡p鏈的過程，也就是說，雙鏈AAV病毒進(jìn)入細(xì)胞后，可以直接表達(dá)，并且表達(dá)時間更快，表達(dá)水平更高。因此，在神經(jīng)研究中，也可以根據(jù)需要選擇scAAV載體，完成目的基因更快表達(dá)，或者基因更強(qiáng)表達(dá)的研究。

三、?啟動子的選擇?

除了AAV載體與血清型，啟動子和調(diào)控元件的優(yōu)化也十分必要。目前，研究中使用的廣譜型啟動子，如巨細(xì)胞病毒啟動子CMV、CMV增強(qiáng)子融合的雞?-肌動蛋白啟動子CAG等，可實(shí)現(xiàn)目的基因的高表達(dá)。四環(huán)素啟動子TRE作為誘導(dǎo)型啟動子，則可以在特定條件下啟動基因的表達(dá)。然而，神經(jīng)系統(tǒng)的組成極其復(fù)雜，腦部的精密研究非常關(guān)鍵，要想實(shí)現(xiàn)某個腦區(qū)甚至是某一類細(xì)胞的特異性感染，選擇一種特異性相對更強(qiáng)的啟動子尤為重要。

下圖為大家列出的是一些常見的神經(jīng)組織特異性啟動子：

四、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件的添加

AAV載體上轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件的添加，對于mRNA的剪接及核輸出、mRNA的穩(wěn)定性及翻譯等具有重要意義，下面列舉兩個對于提高外源基因表達(dá)非常重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。

01?內(nèi)含子

真核mRNA內(nèi)含子在真核生物基因表達(dá)調(diào)控中起著重要的作用，是轉(zhuǎn)基因研究中提高外源基因表達(dá)的重要元件之一。在多數(shù)情況下，真核mRNA內(nèi)含子的存在可以提高基因的表達(dá)水平，因?yàn)槠浼艚舆^程會影響mRNA新陳代謝的多個階段，包括轉(zhuǎn)錄、RNA編輯、pre-mRNA的加工、mRNA的出核運(yùn)輸、翻譯等。所以說，在載體容量允許的情況下可添加一個內(nèi)含子，有助于刺激基因的表達(dá)。

02?WPRE元件

土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列WPRE是一段順式作用的RNA元件，放在多聚腺苷酸化信號之前可顯著增加mRNA的表達(dá)水平和翻譯效率，進(jìn)而增強(qiáng)基因的表達(dá)，并且WPRE插入病毒載體中還可以大大提升病毒包裝的滴度。然而由于WPRE序列較長（600bp左右），所以還需要視具體的載體容量選擇性插入。

五、小結(jié)

值得注意的是，除了以上所述各項(xiàng)因素外，AAV的注射方式，AAV病毒本身的滴度和純度，目的基因本身的自然屬性（如胞內(nèi)蛋白/分泌蛋白/轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）以及AAV感染后所使用的檢測方法等因素也會影響到基因最終的表達(dá)效果。因此，在神經(jīng)系統(tǒng)研究中，想要驅(qū)動更高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以綜合考慮以上各項(xiàng)因素，優(yōu)化選擇。