siRNA的特異性有效保證了哺乳動物細(xì)胞中RNAi效應(yīng)的特異性結(jié)合已有的高效基因?qū)胂到y(tǒng)，使得 RNAi在那些由于基因表達(dá)異常增高而引起的疾?。ㄈ缒[瘤、病毒感染）中的作用優(yōu)于目前以抑制基因表達(dá)為目的而采用的反義技術(shù)和核酶等方法。5-LOX是催化花生四烯酸（AA）生成白三烯（LT）和氫二十碳四稀酸（5HETE）的關(guān)鍵酶，大量實驗研究已證實抑制5-LOX可以抑制多種腫瘤的生長，包括肝細(xì)胞癌。肝細(xì)胞癌已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類健康，建立合適的動物模型是研制抗腫瘤藥和了解腫瘤發(fā)展的重要手段。

No.1

動物的選擇

選取4～6周齡的A/J裸小鼠。

No.2

造模方法

01

細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的篩選及轉(zhuǎn)染效力的驗證

選擇處于對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.2×105個/ml接種底部鋪有小圓玻片的6孔培養(yǎng)板，每孔2ml，保證轉(zhuǎn)染前匯合度80%左右。應(yīng)用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將pRNAT-U6.1-5-LOX-siRNA和空質(zhì)粒pRNAT-U6.1分別轉(zhuǎn)染人HepG2細(xì)胞，分別為陽性干擾組（轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染空白載體質(zhì)粒），并設(shè)立空白組（未做任何轉(zhuǎn)染），于瞬時轉(zhuǎn)染48h，收集細(xì)胞，做熒光定量PCR檢測。熒光定量PCRSYBR Green I熒光染料法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞5-LOX的表達(dá)，驗證轉(zhuǎn)染效力：TR-Lzol試劑抽取總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，按照說明書的操作步驟進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件的設(shè)置：25℃ 10 min，42℃60 min，85℃5min；熒光定量PCR反應(yīng)體系（共50μl）：2×PCR buffer 25 μl，Primers（25 μmol/L）1.2μl，2×SYBR Green I 0.3μl，DNA模板1μl，dH2O 22.5μl；擴(kuò)增條件：94℃4min，94℃20s，60℃30s，72℃30s循環(huán)35次，72℃檢測信號。引物設(shè)計：5LOX Foward：5'-ATGCCTCCTGTCCTTTTCC-3'，5LOX Reverse：5'-ACCTGGTCGCCTCGTAGT-3'，擴(kuò)增片段約為160 bp；β-Actin Forward:5'-TGACCTGGACATCCCCAAAG-3', β-Actin Reverse：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，擴(kuò)增片段約為205 bp。

02

熒光定量PCR結(jié)果表示方法

目的基因表達(dá)量=2-△△CT，△△CT=（CT目的基因-CT內(nèi)標(biāo)基因）實驗組-（CT目的基因-CT內(nèi)標(biāo)基因）對照組，β-Actin 做為內(nèi)標(biāo)基因。2-△△CT：實驗組目的基因相對于對照組的變化倍數(shù)，使用這一方法可以直接得到目的基因相對于內(nèi)參基因的定量。

03

裸鼠皮下移植瘤模型的建立

將上述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在G418選擇性培養(yǎng)基中篩選具有抗性的單細(xì)胞來源的細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。分別獲取 pR-NAT-U6.1-5LOX-siRNA和空質(zhì)粒 pRNAT-U6.1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，裸鼠隨機(jī)分成三組：轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組（每組6只）。調(diào)整三種細(xì)胞密度為1×107個/ml，在無菌條件下于裸鼠背部皮下接種細(xì)胞懸液，按每只1×107個細(xì)胞。飼養(yǎng)21天后對裸鼠進(jìn)行處死。測量腫瘤最長徑和與之垂直的短徑，按下式計算腫瘤體積（V）和腫瘤衰退率（R），V=長徑×短徑2×0.5，R=轉(zhuǎn)染組平均腫瘤體積/未轉(zhuǎn)染組平均腫瘤體積。

04

Western blot 檢測移植瘤體組織中5-LOX蛋白表達(dá)

取各組裸鼠移植瘤組織，用遇冷的PBS洗2次，剪碎，勻漿，加入細(xì)胞裂解液，4℃裂解20min，收集細(xì)胞裂解液，12000r/min離心30min，收集上清液，提取總蛋白。用Bradford比色法測定裂解液中總蛋白含量。取40μl樣本進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離，通過電轉(zhuǎn)印法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶4℃封閉過夜后加入一抗（濃度1：500），4℃溫度中孵育2h，TBST洗滌3次，每次10 min。TBS 洗膜后放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1：5000），37℃孵育1h，再用TBST洗3次，每次10min，加入化學(xué)發(fā)光劑，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。應(yīng)用軟件分析 Western blot結(jié)果。

05

RT-PCR 檢測移植瘤瘤體組織中5-LOXmRNA的表達(dá)

取各組移植瘤組織，采用TRIzol試劑提取總RNA，步驟按試劑盒操作說明書進(jìn)行。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA于95℃變性5min，開始PCR熱循環(huán)：94℃預(yù)變性3min；然后每個循環(huán)：94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；最后72℃終延伸5 min，4℃保存。制備1.5%瓊脂糖凝膠，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行照相。對條帶進(jìn)行光密度掃描，mRNA的表達(dá)強(qiáng)度=目的基因條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。引物設(shè)計：5-LOX上游引物為5'-CCCGGGCATGGAGAGCA-3'，下游引物為5'-GCG-GTCGGCAGCGTGTC-3'，擴(kuò)增片斷長度416bp；β-Actin上游引物為5'-ACCCACACGGTGCCATCTACGAGG-3'，下游引物為5'-AGCTCGTAGCTCTCTCCAGGGAGG-3'，擴(kuò)增片斷長度250 bp。

No.3

結(jié)果

01

HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后熒光定量PCR檢測5-LOX基因表達(dá)量

3組細(xì)胞中，陽性干擾組的5-LOX基因表達(dá)量與陰性對照組比較最低（P<0.01），而陰性對照組與空白組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

02

5-LOX siRNA 轉(zhuǎn)染對裸鼠移植瘤瘤體生長的影響

每組6只裸鼠均在背部皮下肉眼可見腫瘤，成瘤率為100%。轉(zhuǎn)染空載體組和未轉(zhuǎn)染組5~7d后可觀察到皮下結(jié)節(jié)，而轉(zhuǎn)染組10～12d才可觀察到腫瘤結(jié)節(jié)，腫瘤直徑隨時間推移逐漸增大，肉眼見腫瘤位于皮下，表面凹凸不平，呈結(jié)節(jié)狀，實質(zhì)性。本實驗中，無一只裸鼠自然死亡。進(jìn)一步解剖腫瘤，腫瘤表面有出血灶，外觀呈粉紅色，剖面成魚肉狀，中間部分大量壞死，呈灰白色。但各臟器肉眼觀察均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。統(tǒng)計分析顯示：轉(zhuǎn)染組腫瘤體積與未轉(zhuǎn)染組體積相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），轉(zhuǎn)染空載體組與未轉(zhuǎn)染組瘤體體積比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.5），轉(zhuǎn)染組的腫瘤衰退率52.09%。

03

免疫印跡（western-blot）檢測移植瘤組織5-LOX中蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組5-LOX蛋白的表達(dá)量與轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

04

RT-PCR檢測移植瘤組織中5-LOX mRNA表達(dá)水平的影響

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，內(nèi)參照β-Actin表現(xiàn)為擴(kuò)增片斷長度為250bp，寬窄及深淺基本一致的條帶，而5-LOXmRNA表現(xiàn)為擴(kuò)增片斷長度分別為416bp出現(xiàn)寬窄和深淺不一的條帶。經(jīng)密度掃描并計算出的相對系數(shù)顯示，轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中5-LOX mRNA的表達(dá)明顯低于空載體組和未轉(zhuǎn)染組（P<0.01）。

No.4

總結(jié)

引入iRNA干擾技術(shù)，根據(jù)5-LOX基因序列制備雙鏈RNA注入HepG2細(xì)胞內(nèi)引起該基因編碼的mRNA降解，使5-L0X的表達(dá)受抑。該技術(shù)具有序列上的高度特異、抑制基因表達(dá)的高效性、化學(xué)性質(zhì)的高度穩(wěn)定性、抑制作用的迅速性以及 RNAi效應(yīng)的依賴性和避免應(yīng)用藥物抑制劑出現(xiàn)的毒負(fù)作用的缺點，為實驗提供更可靠的數(shù)據(jù)，并在基因研究領(lǐng)域中已逐漸成為常規(guī)技術(shù)。