電離輻射（IR）是疾病診斷和治療必不可少的一部分。流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究表明，電離輻射的廣泛應(yīng)用引起了人們對其有害健康方面的擔(dān)憂。盡管電離輻射治療可以治愈50%的癌癥患者，但輻射毒性、輻射耐受性和癌癥復(fù)發(fā)的挑戰(zhàn)仍然存在。例如，在對電離輻射的反應(yīng)中，癌細(xì)胞可能通過增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)（DDR）、抑制凋亡、自噬或增強(qiáng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），導(dǎo)致癌細(xì)胞對電離輻射具有耐受性，從而發(fā)展免疫逃逸機(jī)制和維持其基因組完整性的能力。

環(huán)狀RNA是在真核生物中通過非典型反向剪接產(chǎn)生的共價(jià)閉合RNA分子，不存在5‘帽子和3’poly-A尾巴，從而賦予環(huán)狀RNA對外切酶的抗性和比線性RNA更高的穩(wěn)定性。越來越多的研究表明，環(huán)狀RNA可以作為生物標(biāo)記物，對疾病診斷、預(yù)后和治療具有重要臨床意義。目前已知，表達(dá)水平失調(diào)的環(huán)狀RNA可以通過作為miRNA海綿和調(diào)控信號通路參與癌癥的發(fā)病機(jī)制，而進(jìn)一步研究環(huán)狀RNA的功能有助于解析肺癌對電離輻射耐受性的潛在分子作用機(jī)制。

2023年8月2日，中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院黃瑞雪教授以及北京放射醫(yī)學(xué)研究所周平坤教授以共同通訊作者在Journal of Advanced Research（IF=10.7）發(fā)表文章“P53-response circRNA_0006420 aggravates lung cancer radiotherapy resistance by promoting formation of HUR/PTBP1 complex”。研究結(jié)果表明，依賴于p53的circRNA_0006420（IRSenss）可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期阻滯和電離輻射誘導(dǎo)的EMT進(jìn)展，影響A549細(xì)胞對電離輻射的敏感性。當(dāng)p53存在時(shí)，經(jīng)輻射后，IRSense的過表達(dá)促進(jìn)了輻射耐受性；然而，當(dāng)p53被敲掉時(shí)，輻射后IRSense的表達(dá)被抑制，則顯示輻射敏感性。此外，作者也證明IRSense可以作為促進(jìn)HUR/PTBP1復(fù)合物形成的支架。從機(jī)制上來講，當(dāng)p53存在時(shí)，IRSenss在電離輻射后定位于細(xì)胞核，并與RNA結(jié)合蛋白HUR相互作用，以阻止宿主PTBP1 mRNA的核輸出，隨后抑制其表達(dá)以促進(jìn)輻射敏感性。本研究進(jìn)一步闡述了circRNA在調(diào)節(jié)電離輻射效果中的作用，為臨床肺癌治療提供了新途徑。

電離輻射后p53會調(diào)控IRSense的表達(dá)

首先作者將A549細(xì)胞分為p53-wt、p53-KO、p53-wt-IR和p53-KO-IR，探索響應(yīng)p53的circRNA，并且使用RNA-seq對circRNA進(jìn)行測序驗(yàn)證。通過差異比對分析，發(fā)現(xiàn)IRSense是在電離輻射后表達(dá)水平上升最多的circRNA。在電離輻射后，IRSense在p53-wt細(xì)胞中表達(dá)水平上調(diào)，而在p53-KO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生變化；同時(shí)，在A549細(xì)胞中過表達(dá)野生型的p53或使用阿霉素激活DDR，兩種方式均會增加IRSense的表達(dá)水平。結(jié)果表明p53會調(diào)控電離輻射后IRSense的表達(dá)（如圖1）。

電離輻射后IRSense上調(diào)，促進(jìn)了肺癌細(xì)胞輻射耐受性

隨后作者評估了IRSense在有無p53情況下的細(xì)胞增殖和針對電離輻射敏感性中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)p53存在時(shí)，過表達(dá)IRSense增加了p53-wt細(xì)胞的增殖，而IRSense基因的下調(diào)則相反。集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，IRSenss的敲低降低了p53-wt A549細(xì)胞的集落面積，但沒有降低p53-KO A549細(xì)胞的集落面積。細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)顯示，與p53-KO A549細(xì)胞相比，p53-wt A549細(xì)胞中IRSense敲低影響了細(xì)胞周期。凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，與p53-KO A549細(xì)胞相比，IRSense的下調(diào)顯著提高了p53-wt A549細(xì)胞的凋亡率。這些結(jié)果表明，p53存在的情況下，輻射后IRSense的表達(dá)增加，導(dǎo)致G2/M阻滯并抑制細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞出現(xiàn)輻射耐受性（如圖2）。

IRSense與電離輻射誘導(dǎo)的DDR和EMT進(jìn)程密切相關(guān)

接著，作者驗(yàn)證了在p53存在的情況下，輻射后IRSense的上調(diào)與DDR通路相關(guān)蛋白的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在4 Gy輻射下，A549細(xì)胞中ATM、CKH2和p-cdc25c水平升高，cdc2水平下降，且呈時(shí)間依賴性。結(jié)果表明，IRSense以p53響應(yīng)的方式調(diào)節(jié)DDR相關(guān)蛋白以應(yīng)對輻射損傷。此外，作者研究了IRSense和EMT的關(guān)系。WB實(shí)驗(yàn)顯示在4Gy輻射處理后，與p53-KO A549細(xì)胞相比，IRSense的下調(diào)增加了p53-wt A549細(xì)胞中的E-cadherin表達(dá)水平，但降低了N-cadherin和viment的表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性。肺組織的H&E染色顯示，注射siIRSense的p53-wt-siIRSense-IR小鼠的炎癥浸潤和膠原纖維沉積減少。這些結(jié)果表明，在p53存在的情況下，IRSense的過表達(dá)促進(jìn)了電離輻射誘導(dǎo)的EMT（如圖3）。

IRSense在電離輻射后定位在細(xì)胞核內(nèi)，與HUR蛋白相互作用

作者上述探討了IRSense介導(dǎo)的輻射誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M阻滯和EMT的分子機(jī)制。作者通過RNA-FISH發(fā)現(xiàn)，IRSense定位于細(xì)胞質(zhì)，在4 Gy輻射后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與p53共定位。通過生信分析，作者預(yù)測了IRSense的結(jié)構(gòu)；發(fā)現(xiàn)IRSense可以形成RNA蛋白復(fù)合物，IRSense可能會與HuR蛋白結(jié)合。通過RIP聯(lián)合LC/MS分析顯示IRSense在A549細(xì)胞中和HUR會相互作用。此外，作者通過RNA pull-down實(shí)驗(yàn)證明RPD-1是最有可能的HUR結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，在p53存在的情況下，IRSense在電離輻射后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與HUR相互作用（如圖4）。

p53促進(jìn)IRSense/HUR/PTBP1復(fù)合物的形成，抑制PTBP1 mRNA的核輸出

此外，作者通過生信分析推測IRSense/HUR/PTBP1復(fù)合物具有調(diào)控功能。通過RNA-FISH分析表明p53-wt A549細(xì)胞經(jīng)4 Gy輻射處理后，敲低IRSense會抑制HUR從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。輻射處理后，IRSense的敲低不影響PTBP1的表達(dá)。PTBP1是一個(gè)與mRNA輸出相關(guān)的剪接因子。因此，作者推測IRSense/HUR復(fù)合物會調(diào)控PTBP1 mRNA的輸出。通過WB以及qPCR檢測表明，在過表達(dá)IRSense的細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)HUR蛋白和mRNA表達(dá)水平升高。RIP實(shí)驗(yàn)證明HUR在A549細(xì)胞中與IRSense和PTBP1 mRNA相互作用。這些結(jié)果表明，在p53存在的情況下，經(jīng)過輻射處理后，過表達(dá)IRSense會促進(jìn)HUR和PTBP1停留在細(xì)胞核內(nèi)（如圖5）。

總結(jié)

綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)在電離輻射后，IRSense在p53-wt細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，但在p53-KO細(xì)胞內(nèi)沒有發(fā)生變化，說明p53會調(diào)控IRSense的表達(dá)。在p53存在時(shí)，輻射后IRSense的上調(diào)通過調(diào)節(jié)DDR通路相關(guān)蛋白誘導(dǎo)G2/M阻滯；同時(shí)，輻射后IRSense的上調(diào)也會促進(jìn)輻射誘導(dǎo)EMT。本研究進(jìn)一步加深了對circRNA在調(diào)節(jié)電離輻射效果中的作用，為有效的臨床肺癌治療提供了新的途徑。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.jare.2023.07.011