3.2.3 表達(dá)載體構(gòu)建

一、表達(dá)載體構(gòu)建

1.基因工程的基本操作程序

①目的基因的篩選與獲取

②基因表達(dá)載體的構(gòu)建

③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

④目的基因的檢測(cè)與鑒定

2.基因表達(dá)載體構(gòu)建

（1）目的

構(gòu)建基因表達(dá)載體是為了使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，復(fù)制，表達(dá)。

（2）過程

（3）基因表達(dá)載體的組成

基因表達(dá)載體包含目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因，(復(fù)制原點(diǎn))。

啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄

終止子：RNA聚合酶脫離部位，終止轉(zhuǎn)錄

標(biāo)記基因：用于鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，例如抗生素抗性基因，熒光蛋白合成基因等

1）單酶切和雙酶切

①單酶切的弊端

單酶切的結(jié)果：①目的基因和質(zhì)粒的正向連接②目的基因和質(zhì)粒的反向連接③目的基因或質(zhì)粒自連。

只有目的基因和質(zhì)粒的正向連接是基因工程中所需要的重組DNA。

②雙酶切的優(yōu)勢(shì)

雙酶切能保證自的基因與運(yùn)載體定向連接，防止目的基因與運(yùn)載體發(fā)生任意連接或自連。

二、導(dǎo)入受體細(xì)胞

1.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

三、目的基因檢測(cè)與鑒定

探針：在含目的基因的DNA片段上用放射性同位素（或熒光分子）標(biāo)記

【DNA分子雜交技術(shù)】將轉(zhuǎn)基因生物的基因組提取出來，在含目的基因的DNA片段上用放射性同位素（或熒光分子）標(biāo)記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，若顯示出雜交帶，就表明目的基因已導(dǎo)入受體細(xì)胞。

【核酸分子雜交技術(shù)】從轉(zhuǎn)基因生物中提取出mRNA，同樣用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交，若顯示出雜交帶，則表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。

【抗原-抗體雜交技術(shù)】從轉(zhuǎn)基因生物中提取出蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原-抗體雜交。若有雜交帶出現(xiàn)，表明目的基因已表達(dá)合成出蛋白質(zhì)。

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