? ? pGlyco2.0是復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院和化學(xué)系教授楊芃原團(tuán)隊(duì)、中國科學(xué)院計(jì)算技術(shù)研究所研究員賀思敏團(tuán)隊(duì)以及國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（上海）研究員黃超蘭團(tuán)隊(duì)合作發(fā)的一款高通量完整糖肽鑒定軟件，發(fā)表在去年的《Nature Communications》上。完整糖肽的高通量鑒定軟件開發(fā)目前是一個(gè)熱點(diǎn)，國內(nèi)外都開發(fā)了不少相關(guān)軟件，商業(yè)化的軟件也有幾款，但是目前的各個(gè)軟件各有長短，質(zhì)量和應(yīng)用性都不令人滿意，很多軟件都早已不更新，目前尚沒有一個(gè)像Macot、Sequest之類的被廣泛接受的軟件或者方法。完整糖肽軟件的高通量鑒定依然處于火熱的方法學(xué)開發(fā)階段。

什么是完整糖肽？

? ? 我們知道，蛋白翻譯后修飾中，糖基化是獨(dú)一無二的，其他的修飾諸如磷酸化、乙?；?、甲基化等，都是一個(gè)固定的化學(xué)基團(tuán)，比如磷酸根、乙?；鶊F(tuán)等連接在蛋白上，但是對于糖基化來說，糖鏈本身就是一個(gè)復(fù)雜多變的生物分子，其序列變化繁多，且糖鏈上面還有磺?；刃揎棧?，糖基化修飾沒有固定的分子量，這對于質(zhì)譜解析蛋白糖基化構(gòu)成了巨大的挑戰(zhàn)。

? ? 長期以來，采用的是糖鏈與蛋白分離的方法，將糖鏈釋放出來單獨(dú)研究糖鏈，至于蛋白部分，N-糖肽在被PNGase F酶切掉糖鏈時(shí)，天冬酰胺會(huì)變成天冬氨酸，增加一個(gè)Da的分子量（在重水中反應(yīng)增加3Da），以此來識(shí)別N-糖基化位點(diǎn)。至于O-糖基化，由于位點(diǎn)密度高、化學(xué)釋放糖鏈時(shí)反應(yīng)劇烈，氨基酸上回發(fā)生多種變化，目前O位點(diǎn)鑒定尚不成熟。

? ? 但是上面的糖鏈和位點(diǎn)分開研究的策略丟失了位點(diǎn)特異性信息，畢竟，發(fā)揮功能的是糖鏈，而不是位點(diǎn)。重復(fù)一遍，發(fā)揮功能的是糖鏈，而不是位點(diǎn)。所以，完整糖肽的策略就是不分開糖鏈與肽段，將完整的糖肽進(jìn)行碎裂。但是，糖肽進(jìn)行CID或者HCD碎裂時(shí)，糖鏈部分優(yōu)先碎裂，肽部分碎裂不充分，這導(dǎo)致糖肽二級(jí)譜圖的解析困難。

? ? 下圖是使用QE+ CE27時(shí)血清糖肽二級(jí)譜圖，可以看出低分子量區(qū)有著極高豐度的氧鎓離子，也就是糖鏈的碎片峰。而b y離子豐度很低。

? ? 解決辦法可以是采用ETD，糖鏈不碎裂而肽碎裂，然后與HCD譜圖結(jié)合起來解析，但是需要兩次進(jìn)樣。Fusion上的EThcD可以自動(dòng)聯(lián)合，但是對于N糖肽來說，需要的電荷至少為4，這是很難做到的。一個(gè)可行的辦法是，采用Stepped CE的方法，也就是一次碎裂中apply不同的碎裂能，實(shí)現(xiàn)糖鏈和肽段的雙重充分碎裂。pGlyco2.0采用的就是這種方法。?

? ? pGlyco1.0采用的是HCD-pd-CID或者M(jìn)S3的方法，也就是HCD碎一次，CID和MS3各來一次，這種方法也行，但是速度太慢了。

? ? pGlyco2.0采用了SteppedCE方法，也就是用CE20 30 40這三個(gè)能量各打一次，不過，Thermo儀器上三個(gè)能量的滯留時(shí)間似乎是不可調(diào)的。荷蘭的Wuhrer教授用布魯克的Q-TOF的Stepped CE中的不同step的碎裂能時(shí)間可調(diào)的特性，實(shí)現(xiàn)了糖肽的充分碎裂。這個(gè)以后再探討。pGlyco2.0采用了這種方法后，實(shí)現(xiàn)了糖肽的較好的碎裂。此外，pGlyco2.0另一大亮點(diǎn)是采用了高準(zhǔn)確度的FDR算法，從肽骨架、糖鏈和糖肽三個(gè)層次綜合控制FDR【pGlyco的FDR算法研究一直走在同行的前列，事實(shí)上，完整糖肽鑒定軟件的開發(fā)中，F(xiàn)DR控制算法的設(shè)計(jì)是重中之重】。

? ? ?pGlyco對糖肽譜圖的解析思路并不復(fù)雜，首先，需要有一個(gè)糖庫，糖鏈數(shù)據(jù)庫比較著名的有GlycomeDB，不過現(xiàn)在已經(jīng)改名為GlyTouCan了。目前pGlyco內(nèi)置了人和老鼠的糖鏈數(shù)據(jù)庫。不支持自己添加糖鏈數(shù)據(jù)庫。然后你需要有一個(gè)蛋白數(shù)據(jù)庫。軟件會(huì)對一張譜圖分別進(jìn)行肽段by離子的匹配以及糖庫的匹配，最后進(jìn)行打分和FDR控制。

初步測評(píng)結(jié)果：

? ? pGlyco2目前已經(jīng)更新了多個(gè)版本，原始文獻(xiàn)中給出的版本和現(xiàn)在的版本在界面上有很大不同。我嘗試使用了QE（沒有使用stepped CE）的糖肽數(shù)據(jù)進(jìn)行了測試，有意思的是，當(dāng)時(shí)使用文獻(xiàn)中給出的地址下載的版本鑒定到了800條左右糖肽（包含部分O-糖肽），當(dāng)下載了新版的pGlyco2.1重新對同一個(gè)Raw檢索時(shí)，鑒定數(shù)目為：0。也就是說，同樣一個(gè)Raw文件，使用舊版本可以鑒定到800條糖肽，而使用新版本一條都鑒定不到（我嘗試了多次，確保參數(shù)沒有設(shè)置錯(cuò)誤）。而使用GPQuest的結(jié)果則在2000以上。

? ? 由于算法不同且碎裂能模式不同，采用的樣品處理策略也不同，pGlyco和GPQuest的結(jié)果沒有可比性，這里的結(jié)果當(dāng)然不能說哪個(gè)軟件好哪個(gè)不好。但是pGlyco前后版本的巨大差異……只能理解為新版本上其算法可能有了改變吧。

參考文獻(xiàn)：

pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification

鏈接：http://pfind.ict.ac.cn/software/pGlyco/index.html