今天小云教你一個解決辦法，就是做雙熱點(diǎn)分析思路，可以選擇兩種細(xì)胞死亡方式聯(lián)合分析！這樣分析思路不容易撞車~

接下來小云給你們看一篇同時對銅死亡和鐵死亡進(jìn)行分析的文章，還有二次聚類和選擇性多聚腺苷酸化（APA）的分析！

ps：APA是一種重要且廣泛存在的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程，其通過選擇不同的Poly(A)位點(diǎn)，影響mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率和蛋白的細(xì)胞定位等重要過程?；贏PA進(jìn)行生信分析也是個不錯的選擇哦~

題目：銅死亡和鐵死亡調(diào)節(jié)因子之間的相互對話為肺腺癌的預(yù)后預(yù)測和治療定義了腫瘤微環(huán)境

雜志：Frontiers in immunology

影響因子：8.786

發(fā)表時間：2023年1月

數(shù)據(jù)信息

研究思路

分析TCGA和GEO數(shù)據(jù)評估銅死亡調(diào)控因子。分析33種癌癥類型中銅死亡和鐵死亡調(diào)控因子之間的分子相關(guān)性，表明銅死亡和鐵死亡調(diào)控因子存在相互作用。然后識別了三個基于銅死亡和鐵死亡調(diào)控因子的不同簇，稱為CuFeclusters，以及三個不同的銅死亡/鐵死亡基因亞群。三種CuFecluster的腫瘤微環(huán)境細(xì)胞浸潤特征與腫瘤的三種免疫表型高度一致。此外，構(gòu)建并驗(yàn)證了CuFescore評分，以預(yù)測個體銅死亡/鐵死亡途徑以及對化療藥物和免疫治療的反應(yīng)。CuFescore評分與miRNA表達(dá)及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控顯著相關(guān)。

分析流程圖

主要研究結(jié)果

1.?LUAD中銅死亡調(diào)節(jié)因子的遺傳和表達(dá)變化

首先分析了14種銅死亡調(diào)節(jié)因子的遺傳改變，包括體細(xì)胞突變率、突變頻率和染色體位置等（圖1A-B）。然后分析了銅死亡調(diào)節(jié)因子的mRNA表達(dá)(圖1C)。并在NSCLC (A549)和正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)中驗(yàn)證了銅死亡基因的表達(dá)(圖1D)。利用scRNA-seq分析主要的細(xì)胞亞群(圖1E-F)和銅死亡基因的表達(dá) (圖1H)。單因素Cox回歸分析確定了銅死亡基因在LUAD患者中的預(yù)后意義(圖1I)。

圖1. 銅死亡調(diào)控因子在LUAD中的遺傳及表達(dá)變化

2.?銅死亡和鐵死亡調(diào)節(jié)因子之間的互作

泛癌分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)銅死亡和鐵死亡調(diào)控因子在33種癌癥類型中表現(xiàn)出相似的突變頻率(圖2A)，且兩者之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性(圖2B)。GeneMANIA數(shù)據(jù)庫中分析了銅死亡和鐵死亡調(diào)控因子的相互作用(圖2C)。通過WGCNA分析銅死亡和鐵死亡的關(guān)鍵基因(圖2D)。在不同的癌癥中，關(guān)鍵銅死亡調(diào)控因子的數(shù)量與鐵死亡調(diào)控因子的數(shù)量密切相關(guān)(圖2E)。將siRNA轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，以驗(yàn)證銅死亡和鐵死亡調(diào)控因子之間的相關(guān)性(圖2F)。

圖2.銅死亡和鐵死亡調(diào)節(jié)因子之間的互作

3.?銅死亡和鐵死亡不同聚類的腫瘤微環(huán)境細(xì)胞浸潤特征

基于銅死亡和鐵死亡調(diào)控因子水平的無監(jiān)督聚類，來自6個隊列的患者分為3個亞型，分別為CuFecluster A/B/C(圖3A)。CuFecluster B組患者比A組和C組患者預(yù)后更好(圖3B)。進(jìn)行GSVA富集途徑確定3種CuFeclusters的生物學(xué)功能，CuFecluster B與免疫充分激活相關(guān)(圖3C, D)，并且CuFecluster B富含各種活化免疫細(xì)胞的浸潤(圖3E)，CuFecluster B被歸類為免疫炎癥表型,CuFecluster A也與TGF-β家族成員和TGF-β家族成員受體高度相關(guān)(圖3F)，代表免疫排除亞型。CuFecluster C免疫細(xì)胞數(shù)量較少，與免疫荒漠表型特征一致。

圖3. 不同CuFecluster的腫瘤微環(huán)境細(xì)胞浸潤特征

4.?二次聚類確定銅死亡/鐵死亡相關(guān)基因亞型及CuFescore的建立

分析不同CuFecluster間的差異表達(dá)基因（DEGs），得到108個DEGs(圖4A)，并通過單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)105個DEGs具有預(yù)后意義。進(jìn)行第二次無監(jiān)督聚類分析，并將患者分為3個基因組亞型（genecluster A/B/C）。genecluster?A的預(yù)后較好(圖4B)。

構(gòu)建評分CuFescore(圖4C)，CuFecluster B(圖4D)和genecluster A(圖4E)的患者CuFescore較低。CuFescore低組的生存率較高(圖4F)，與死亡病例相比，存活病例的平均CuFescore較低(圖4G)。Kaplan-Meier分析顯示低CuFescore組患者預(yù)后較好(圖4H)。分析低CuFescore組的富集通路(圖4I)、與早期臨床和病理特征及分期相關(guān)(圖4J)。時間依賴性AUC曲線確定CuFescore作為患者OS的預(yù)測生物標(biāo)記物(圖4K)。

圖4.?CuFescore的構(gòu)建和預(yù)后價值

5?CuFescore與免疫檢查點(diǎn)之間的關(guān)系

分析免疫治療相關(guān)參數(shù)，腫瘤突變負(fù)荷(TMB)和免疫檢查點(diǎn)。高CuFescore組TMB更高(圖5A-C)。低CuFescore和高TMB患者表現(xiàn)出良好的預(yù)后(圖5D)。分析兩個CuFescore組之間免疫細(xì)胞的差異(圖5E-F)。CuFescore與HLA家族基因和免疫檢查點(diǎn)表達(dá)顯著相關(guān)(圖5G-I)。

圖5.?CuFescore與免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性

6.?高、低CuFescore組的突變狀態(tài)

分析CuFescore高組和低組之間的體細(xì)胞突變、突變頻率，以及差異基因突變的相互作用。

圖6. CuFescore與腫瘤突變狀態(tài)的關(guān)系

7.?CuFescore預(yù)測化療和免疫治療效果

評估CuFescore對化療藥物反應(yīng)性的預(yù)測價值，計算138種藥物的IC50值(圖7A-E)。計算2個免疫治療隊列患者的CuFescore，將其分為高CuFescore組和低CuFescore組。CuFescore低的患者預(yù)后更好，表現(xiàn)出顯著的治療效果(圖7A-K)。

圖7. CuFescore在化療和免疫治療中的作用

8.?CuFescore與miRNA和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關(guān)

為了評估CuFescore在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后過程中的調(diào)節(jié)作用，分析了APA事件。鑒于APA處理的轉(zhuǎn)錄本具有短的3'UTR，因此耐受miRNAs的調(diào)控。在TCGA-LUAD隊列中，在CuFescore高組和低組之間檢測到79個差異表達(dá)的miRNA (圖8A)。分析CuFescore高組和低組之間APA差異的基因，并檢驗(yàn)其預(yù)后意義，以顯示3'UTR長度是否影響LUAD患者的生存(圖8B)。APA事件延長的基因?qū)儆诘虲uFescore組，與延長的生存期一致(圖8C)。TM9SF3和ATP2A2 這2個基因轉(zhuǎn)錄本短與個體預(yù)后較差存在相關(guān)性(圖8D)。TM9SF3在3'UTR上被miR-1193直接靶向。推測由于基因的3’-UTR縮短，miRNA可能無法與基因結(jié)合，從而消除了對癌基因的抑制作用，促進(jìn)了LUAD的進(jìn)展。

圖8.?CuFescore與轉(zhuǎn)錄后特征的相關(guān)性

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總結(jié)

這篇文章最大的亮點(diǎn)就是同時分析了鐵死亡和銅死亡2種細(xì)胞死亡方式，進(jìn)行疾病分型+構(gòu)建風(fēng)險評分，分析內(nèi)容并不復(fù)雜。與單一死亡方式相比，瞬間提升了創(chuàng)新性，而且這種雙熱點(diǎn)的分析思路可以任意搭配，不容易撞車~

另外可以借鑒二次聚類和選擇性多聚腺苷酸化（APA）的相關(guān)分析。亮點(diǎn)多多，非常值得借鑒！?

如果你還苦惱于課題或分析沒有思路，或者對多種細(xì)胞死亡等熱點(diǎn)方向感興趣的小伙伴快來聯(lián)系小云吧！