最近經(jīng)常聽(tīng)到小伙伴們苦惱于流式結(jié)果不理想，這篇文章為大家總結(jié)了一系列流式實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題，看完絕對(duì)可以有效避坑（建議存入收藏夾備用）！

一、無(wú)信號(hào)/熒光強(qiáng)度弱

●?補(bǔ)償問(wèn)題

多色流式配色很關(guān)鍵，低表達(dá)的抗原可以用相同熒光素的高表達(dá)抗原代替，或者使用補(bǔ)償微球。

●?用于檢測(cè)的抗體不足

一定要做抗體滴定，按照說(shuō)明書(shū)的要求加抗體。

●?無(wú)法接近細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)

確定好抗原的表達(dá)位置，選擇合適的染色方法和刺激方法。

●?激光器未對(duì)齊

做實(shí)驗(yàn)前一定要確保儀器沒(méi)有問(wèn)題。流式細(xì)胞儀是流式的三大基本要素之一，要經(jīng)常維護(hù)儀器，做質(zhì)控，并清洗儀器。確保流式細(xì)胞儀上的激光器正確對(duì)齊，必要時(shí)通過(guò)運(yùn)行液流檢查微珠來(lái)調(diào)整路線。如果激光器未正確對(duì)齊或發(fā)生偏移，則可能需要考慮維修機(jī)器。

●?靶蛋白不存在/低水平表達(dá)

確保您正在分析的組織/細(xì)胞類型能表達(dá)靶蛋白，并且靶蛋白的量足以被檢出。

●?細(xì)胞因子類marker

正常的淋巴細(xì)胞處于未激活狀態(tài)，不會(huì)分泌細(xì)胞因子。因此要選擇合適的方法激活淋巴細(xì)胞，使其釋放細(xì)胞因子，達(dá)到檢測(cè)水平。同時(shí)要加蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑使其留在胞內(nèi)，然后固定破膜，染相應(yīng)抗體。細(xì)胞刺激劑、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑以及固定破膜的試劑的選擇都會(huì)影響染色結(jié)果。

●?熒光淬滅

抗體可能存放太久或沒(méi)有避光。還要考慮固定試劑的問(wèn)題。

●?一抗和二抗不匹配

使用的二抗應(yīng)與一抗來(lái)源種屬不同（例如，一抗為兔源，則應(yīng)該使用抗兔源二抗）。為了解決種屬交叉反應(yīng)性的問(wèn)題，您可以使用經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證的直接偶聯(lián)一抗，或者使用偶聯(lián)物試劑盒，在您選擇的抗體中加入合適的熒光染料。

二、熒光強(qiáng)度高

●?抗體濃度過(guò)高

做抗體滴定。

●?過(guò)量抗體被捕獲

胞內(nèi)染色特有的問(wèn)題。染色后，充分清洗。也有可能是破膜劑的問(wèn)題，破膜不夠充分。

●?無(wú)法接近細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)

確定好抗原的表達(dá)位置，選擇合適的染色方法和刺激方法。

●?封閉不足

做Fc受體阻斷是一個(gè)特別好的流式習(xí)慣，但不是所有的細(xì)胞都需要做封閉，做封閉是為了減少非特異性結(jié)合。

三、背景高/陽(yáng)性細(xì)胞百分比高

●?增益設(shè)置過(guò)高/補(bǔ)償過(guò)低

使用陽(yáng)性對(duì)照正確設(shè)置流式細(xì)胞儀，使用補(bǔ)償減少小顆粒背景信號(hào)并減少增益，以降低信號(hào)。

●?抗體過(guò)量

抗體滴定。清洗充分。

四、在應(yīng)該只有1個(gè)細(xì)胞群時(shí)觀察到2個(gè)或以上

●?表達(dá)目的marker的細(xì)胞群不止一個(gè)

做實(shí)驗(yàn)前要確定好目的細(xì)胞的目的marker。

●?出現(xiàn)細(xì)胞雙峰

細(xì)胞雙峰顯示為第二大細(xì)胞群，其熒光強(qiáng)度大約是單細(xì)胞熒光強(qiáng)度的兩倍。制樣和上機(jī)的過(guò)程要確保是單細(xì)胞懸液，并且過(guò)濾掉大的組織團(tuán)塊。

一定要做抗體滴定，按照說(shuō)明書(shū)的要求加抗體。

五、側(cè)向散射背景偏高（來(lái)自小顆粒）

●?細(xì)胞裂解

制樣問(wèn)題，保證細(xì)胞的活力，不能有太多碎片。注意離心條件和渦旋力度。

●?細(xì)菌污染

確保樣本不受污染。細(xì)菌會(huì)自動(dòng)發(fā)出較弱的熒光，導(dǎo)致高事件率。

●?去死活

樣本制備不可避免的會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞死亡或壞死，特別是實(shí)體組織制備的單細(xì)胞懸液，一定要染死活，不染自發(fā)熒光會(huì)很高，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

六、其他

●?細(xì)胞量

正常1×106個(gè)細(xì)胞/100 μL體系中染色。表達(dá)量高的膜表面分子可以體系減半抗體減半。固定破膜的過(guò)程中，會(huì)損失掉一些細(xì)胞。因此，表達(dá)量低、胞內(nèi)、核內(nèi)分子可以加大細(xì)胞量，相應(yīng)體積的抗體也可以對(duì)應(yīng)細(xì)胞量多加，一定要做預(yù)實(shí)驗(yàn)和抗體滴定，摸索最佳染色效果。

●?電壓

裸細(xì)胞調(diào)完FSC、SSC的電壓，記得調(diào)熒光通道的電壓。

●?對(duì)照

一定要設(shè)置好對(duì)照組，補(bǔ)償對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照（生物學(xué)對(duì)照）、同型對(duì)照、FMO對(duì)照。

●?細(xì)胞聚集，阻塞管道

制樣的過(guò)程中一定要確保是單細(xì)胞懸液，制樣和上機(jī)的時(shí)候過(guò)濾掉組織團(tuán)塊。

●?固定

某些熒光素對(duì)多聚甲醛敏感，要注意，可以選擇成品、溫和的固定液。如果固定過(guò)夜，上機(jī)前要清洗掉多聚甲醛再上機(jī)。

最后提醒大家：一定要做預(yù)實(shí)驗(yàn)和抗體滴定，把所有的對(duì)照都設(shè)置好，預(yù)實(shí)驗(yàn)盡可能排除掉所有可能出現(xiàn)的問(wèn)題，穩(wěn)定條件，甚至可以再流式細(xì)胞儀上設(shè)好panel，再上大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)！

七、資料獲取

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