APSB佳作:腸道菌群影響抗PD單體的代謝吸收機(jī)制！

? ??本期主要看下Acta Pharmaceutica Sinica B（if11.413）里的一篇文章：Gut microbiota mediates the absorption of FLZ, a new drug for Parkinson’s disease treatment，看腸道菌群對一種抗帕金森病的新藥吸收的調(diào)控作用是如何研究設(shè)計(jì)的。本文主要是看作者的邏輯思維和設(shè)計(jì)思路。（本文涉及腸道菌群但并未做代謝組學(xué)，主要是考察藥物吸收代謝過程）

FLZ，是一種新型的鱗狀酰胺合成衍生物，在帕金森病(PD)上的應(yīng)用正在進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)。我們之前的研究表明，F(xiàn)LZ可以通過血腦屏障(BBB)，并對幾種實(shí)驗(yàn)性PD模型具有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用。然而，目前FLZ代謝和吸收的潛在機(jī)制仍未完全闡明。

1.首先確定FLZ的代謝產(chǎn)物

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? ? ??先采用LC/MSnIT-TOF技術(shù)檢測的結(jié)腸中FLZ及其他代謝成分的含量。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中檢測到了FLZ的8種代謝物，其中FLZ的去甲基化產(chǎn)物M1是數(shù)量上的主要代謝物。由于M1在糞便中含量豐富，我們推測腸道微生物群可能參與了FLZ向M1的轉(zhuǎn)化。

? ??再絕對定量結(jié)果顯示，幾乎所有FLZ在結(jié)腸含量60min后均轉(zhuǎn)化為M1，生成的M1在60~240分鐘內(nèi)處于穩(wěn)定水平，說明在此期間，M1沒有被腸道微生物群代謝。為了進(jìn)一步確定腸道微生物群負(fù)責(zé)FLZ-到-M1的轉(zhuǎn)化，我們將FLZ(50mg/mL)與15株腸道微生物群菌株在體外孵育，然后檢測培養(yǎng)物中M1和FLZ的濃度。值得注意的是，鮑曼不動(dòng)桿菌中M1/FLZ的比值高于所有其他被研究的細(xì)菌。這些數(shù)據(jù)表明，M1是FLZ被腸道微生物群轉(zhuǎn)化的主要代謝物。

2.明確肝、腎和小腸并不是FLZ向M1轉(zhuǎn)化的主要器官，腸道菌群具有該轉(zhuǎn)化的獨(dú)特性

? ? ??為了確定腸道微生物群是否具有特異性，并主要負(fù)責(zé)FLZ-到-M1的轉(zhuǎn)化，我們將FLZ(0.2mg/mL)或M1(0.2mg/mL)與富含藥物代謝酶的不同代謝成分孵育。FLZ可被小腸微粒體代謝，而未檢測到M1。而M1幾乎沒有被小腸微粒體代謝。表明M1在小腸微小體中不是FLZ的代謝物。這些結(jié)果排除了肝、腎和小腸在FLZ向M1代謝中的作用，并間接證實(shí)了腸道微生物群在FLZ-向-M1轉(zhuǎn)化中的獨(dú)特性。

3.是什么酶參與了代謝過程

? ? ? 我們進(jìn)一步探索了參與腸道微生物群中FLZ轉(zhuǎn)化為M1的酶。報(bào)道顯示：CYP51是腸道微生物群中最豐富的去甲基化酶，在代謝FLZ為M1的主要細(xì)菌鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)了高水平的CYP51活性。

? ? ??然后，我們通過BIOVIA工作室客戶端軟件進(jìn)行計(jì)算機(jī)助理虛擬對接，以研究CYP51與FLZ的結(jié)合活性。結(jié)果表明，F(xiàn)LZ對CYP51具有良好的對接性能，結(jié)合自由能為56.0122千卡/mol。為了進(jìn)一步闡明CYP51是否是介導(dǎo)FLZ去甲基化的關(guān)鍵酶，我們使用CYP51抑制劑，伊曲康唑和伏立康唑，進(jìn)一步驗(yàn)證了這一推測。研究結(jié)果提示CYP51在腸道微生物群中的活性與FLZ的代謝能力呈正相關(guān)，支持了我們發(fā)現(xiàn)CYP51可能是FLZ轉(zhuǎn)化為M1的關(guān)鍵酶。

4.由于該物質(zhì)是治療帕金森病，故對小鼠血漿和腦中FLZ和M1的藥代動(dòng)力學(xué)研究

? ? ? 當(dāng)口服等劑量M1的小鼠時(shí)，很快檢測到FLZ，濃度在2h達(dá)到峰值，Cmax約為259.8ng/mL，而血漿中M1的濃度僅為約1~2ng/mL。提示在體內(nèi)可能存在從M1到FLZ的轉(zhuǎn)化模式。

? ? ??然后，我們研究了小鼠大腦中FLZ的濃度。結(jié)果表明，口服FLZ或M1均能檢測到FLZ，而M1濃度低于LC-MS/MS分析的檢測限(0.1ng/mL)。值得注意的是，給藥M1 2h后，腦內(nèi)FLZ水平達(dá)到峰值，濃度-時(shí)間曲線與血漿FLZ曲線一致。這些數(shù)據(jù)表明，在M1在體內(nèi)被吸收后，可能存在從M1向FLZ的轉(zhuǎn)化。

5.血液中是什么參與了M1向FLZ的轉(zhuǎn)化

? ? ? 上述研究表明M1在血液中被重新甲基化。然后我們試圖找出是哪一種酶負(fù)責(zé)血液中M1的甲基化。由于COMT是血液中主要的甲基化酶，我們通過BIOVIA Studin客戶端軟件進(jìn)行了計(jì)算機(jī)助理虛擬對接，以研究COMT與M1的結(jié)合活性。然后用COMT抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證。推測COMT可能是M1轉(zhuǎn)化為FLZ的關(guān)鍵酶。

6.腸道菌群對慢性PD小鼠模型中FLZ的吸收影響

? ? ? 為了進(jìn)一步驗(yàn)證腸道微生物群有助于FLZ的吸收，我們開發(fā)了偽無菌(PGF)小鼠和PGF+MPTP/p中毒PD小鼠模型。

? ? ??與相應(yīng)的對照組小鼠相比，抗生素暴露的PGF小鼠和PGF+MPTP/p小鼠血漿中FLZ和M1的濃度分別顯著降低。在小鼠PGF狀態(tài)下，F(xiàn)LZ和M1在腦中的分布也明顯降低。此外，腸道菌種失調(diào)導(dǎo)致收集的24小時(shí)糞便中FLZ濃度增加，M1濃度降低。

7.PD小鼠腸菌種失調(diào)，FLZ療效降低

? ? ??既然腸道菌群失調(diào)影響FLZ轉(zhuǎn)化為M1，那這會(huì)影響FLZ的治療PD效果嗎？故進(jìn)一步探討了腸道微生物群在MPTP/p誘導(dǎo)的慢性PD小鼠模型中FLZ的神經(jīng)保護(hù)中的作用。

? ? ??結(jié)果顯示，F(xiàn)LZ(75mg/kg)治療顯著增加了PD小鼠停留在桿上的時(shí)間，大量黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量和DA及其代謝物的濃度，表明FLZ改善了運(yùn)動(dòng)行為和多巴胺能神經(jīng)元功能，而FLZ未能緩解抗生素誘導(dǎo)的帕金森病的癥狀和病理狀態(tài)。此外，與單獨(dú)處理的小鼠中腦FLZ相比，使用抗生素減弱了FLZ對小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的抑制，這表明CD68和GFAP的表達(dá)、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)記物增加。

【討論】

? ? 本文作者通過自己的設(shè)計(jì)和邏輯，將抗PD新藥體內(nèi)吸收如何受腸道菌群調(diào)控探究清楚，很有新意，值得借鑒。