在真核細胞中，前體mRNA的選擇性剪接是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中的一個關(guān)鍵加工步驟，選擇性剪接發(fā)生在一個稱為剪接體的大型動態(tài)復合體中。RNA與小核核糖核蛋白(snRNP)和非snRNP動態(tài)相互作用。非snRNPs主要由異質(zhì)核核糖核蛋白(hnRNPs)和富含絲氨酸/精氨酸(SR)的蛋白組成。SR蛋白在植物發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。研究表明，SR45對擬南芥發(fā)育是必需的。然而，SRPKs如何調(diào)控SR蛋白以及如何在轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接過程中介導SR蛋白磷酸化尚不清楚。

2023年3月，山東師范大學馬長樂教授團隊在期刊New Phytologist（IF 9.4）上發(fā)表了題為“Arabidopsis SRPKII family proteins regulate flowering via phosphorylation of SR proteins and effects on gene expression and alternative splicing”的文章。該團隊進行了蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學和遺傳學實驗，探究SRPKs在植物中的作用。研究表明，SRPKIIs通過調(diào)節(jié)特定SR蛋白的磷酸化和定位來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接，最終調(diào)節(jié)FLC (Flowering Locus C)的轉(zhuǎn)錄以及選擇性剪接來控制擬南芥的開花時間。中科新生命為該研究提供了TMT磷酸化蛋白質(zhì)組學技術(shù)服務。

?研究材料

擬南芥

?技術(shù)路線

步驟1：探究植物中SRPK蛋白的生物學功能；

步驟2：SRPK蛋白的亞細胞定位；

步驟3：SRPKIIs調(diào)節(jié)SR蛋白亞類的磷酸化；

步驟4：SRPKIIs與SR蛋白亞類相互作用，并影響其亞細胞定位。

?研究結(jié)果

1. 探究植物中SRPK蛋白的生物學功能

在本研究中，作者為了研究植物中SRPK蛋白的生物學功能，在擬南芥SRPK1、SRPK3和SRPK5基因的外顯子中獲得了T-DNA插入突變體(圖1a)。CRISPR/Cas9介導的SRPK2和SRPK4基因突變分別產(chǎn)生了srpk1/2 (srpki)雙突變體和srpk 3/4/5(srpkii)三突變體(圖1)。與Col-0相比，srpkii-1突變體表現(xiàn)出開花延遲、花瓣異常、角質(zhì)化葉序排列異常和花不對稱(圖1a，b)。此外，在長日照(LD)條件下，srpkii-1突變體在開花時比Col-0產(chǎn)生更多的蓮座葉(圖1c)。為了進一步證實srpkii突變體的表型是由SRPKII基因的破壞引起的，在srpkii-1突變體中引入了一個SRPK4啟動子驅(qū)動的構(gòu)建體，以產(chǎn)生兩個株系(srpkii-1 SRPK4 res)。兩個獨立的株系srpkii-1 SRPK4 顯示出與Col-0相似的表型(圖1b-d)。這些結(jié)果表明，srpkii突變體的表型變化和SRPK3、SRPK4和SRPK5基因的缺失相關(guān)。

2. SRPK蛋白的定位

為了確定SRPKII蛋白的亞細胞定位，將SRPKIIs與EYFP融合，使用與CFP融合的SCL33作為核標記。共表達35S::EYFP-SRPKIIs和35S::CFP-SCL33。在細胞質(zhì)和細胞核中都檢測到了EYFP-SRPK3、EYFP-SRPK4和EYFP-SRPK5的熒光信號(圖2a)。為了闡明SRPKII基因的表達模式，將SRPKIIs的啟動子分別與β-葡萄糖醛酸酶(GUS)報告基因融合，并轉(zhuǎn)化到擬南芥中。選擇每份遺傳材料的兩個獨立品系進行GUS染色。GUS染色顯示SPRKIIs在幼苗、莖尖、蓮座、莖葉、花和葉柄中廣泛表達(圖2b)。這些結(jié)果表明，SRPKIIs可能在整個擬南芥生命周期的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

3. SRPKIIs調(diào)節(jié)SR蛋白亞類的磷酸化

作者使用了TMT磷酸化蛋白組學技術(shù)進一步研究SRPKIIs如何參與植物的mRNA剪接并鑒定SRPKIIs的潛在底物。從srpkii-1和Col-0的蓮座葉中鑒定到11200個磷酸化肽，15985個磷酸化位點，對應于4834個磷酸化蛋白。與Col-0相比，在srpkii-1突變體中鑒定出760個差異表達的磷酸化肽（DEPPs），其中349個上調(diào)，411個下調(diào)，共鑒定出496種顯著差異磷酸化的蛋白(DPP)，其中269種上調(diào)，227種下調(diào)(圖3a)。聚類分析顯示，srpkii-1突變體與Col-0的磷酸化水平不同(圖3b)。

對所有鑒定出的DPP進行GO功能注釋。這些DPP主要集中在與RNA代謝相關(guān)的重要生物過程中(mRNA剪接、核糖體生物合成、核糖核蛋白復合體生物合成、RNA加工、核糖體小亞基生物合成、rRNA加工)，證實了SRPKIIs在RNA加工中起作用(圖3c)。使用MEME軟件鑒定了在srpkii-1突變體中顯著下調(diào)的蛋白磷酸化修飾位點的保守基序。得到兩個顯著保守基序......_S_P.....和....S._S_......(點代表任何氨基酸)(圖3d)。

在磷酸化蛋白質(zhì)組學實驗中，鑒定到19個SR蛋白中的17個對應181個磷酸肽。除SR34B和SCL28外，所有SR蛋白均被磷酸化。srpkii-1突變體中SR45、SC35、SCL30A和RSZ21的RS結(jié)構(gòu)域磷酸化水平顯著下調(diào)(圖3e)，說明這4種SR蛋白中RS結(jié)構(gòu)域的磷酸化主要受srpkii控制。與Col-0植物相比，srpkii-1突變體中RSZ22A、RS2Z32、RS2Z33以及RS蛋白家族的所有4個成員(RS31、RS31A、RS40和RS41)的RS結(jié)構(gòu)域磷酸化水平略有下調(diào)(圖3e)，表明這些SR蛋白的磷酸化也可能是SPRKII蛋白的底物。

4. SRPKIIs與SR蛋白亞類相互作用，并影響其亞細胞定位

進一步對擬南芥葉表皮細胞進行雙分子熒光互補(BiFC)分析，以研究SRPKIIs和SR蛋白之間的體內(nèi)相互作用。對于srpkii-1突變體(SR45、SC35、SCL30A和RSZ21)中RS結(jié)構(gòu)域磷酸化狀態(tài)受到顯著影響的SR蛋白，在與CFPSCL33標記的細胞核共定位的點狀結(jié)構(gòu)中檢測到熒光信號(圖4)。此外，在檢測SRPKIIs與SR45蛋白之間的相互作用時，在未與細胞核共定位的胞質(zhì)溶膠中觀察到清晰的點狀熒光信號，表明SRPKIIs在細胞核和胞質(zhì)溶膠中均與SR45蛋白相互作用。在srpkii-1突變體中，七種SR蛋白(RS31、RS31A、RS40、RS41、RSZ22A、RS2Z32、RS2Z33)的RS結(jié)構(gòu)域磷酸化狀態(tài)受到輕度影響。其中，通過BiFC分析發(fā)現(xiàn)僅RS31、RS41和RS2Z32與SRPKIIs相互作用(圖4)。

確定SRPKIIs對SR蛋白的磷酸化對亞細胞定位的影響，作者將表達SR45-GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Col-0、srpki-1和srpkii-1突變體的原生質(zhì)體中。發(fā)現(xiàn)在Col-0和srpki-1原生質(zhì)體中，SR45-GFP靶向細胞核(圖5a)。相比之下，在srpkii-1原生質(zhì)體細胞中，SR45-GFP定位于細胞核、細胞質(zhì)和細胞質(zhì)點狀結(jié)構(gòu)(圖5a)，表明敲除SRPKii基因會影響SR45的亞細胞定位。為了證實SR45的亞細胞定位受其磷酸化狀態(tài)的影響，我們將SR45(通過TMT鑒定)RS結(jié)構(gòu)域上的所有磷酸化位點從絲氨酸或蘇氨酸突變?yōu)楸彼?圖3e)，從而模擬了磷酸化死亡的SR45蛋白(SR45 (S/A)突變體)。在Y2H實驗中，SR45 (S/A)突變體不能與SRPKIIs相互作用，在BiFC分析中也未能與SRPK4或SRPK5相互作用(圖5b，c)。SR45 (S/A)突變體僅在細胞質(zhì)點狀結(jié)構(gòu)中的SRPK3相互作用(圖5c)?？傊?，這些結(jié)果表明SR45的磷酸化調(diào)節(jié)其亞細胞定位。

?文章小結(jié)

研究團隊發(fā)現(xiàn)SPRKIIs調(diào)節(jié)特定SR蛋白的RS結(jié)構(gòu)域磷酸化狀態(tài)，介導其亞細胞定位和其他蛋白的結(jié)合。R45突變體通過抑制ASAP(凋亡剪接相關(guān)蛋白)復合物的組裝，使表觀遺傳修飾FLC(Flowering Locus C)的表達上調(diào)。在srpkii突變體的莖尖，F(xiàn)LC內(nèi)含子的剪接效率顯著提高。轉(zhuǎn)錄組學分析顯示，SRPKIIs調(diào)節(jié)了大約400個基因的選擇性剪接，這些基因與SR45和SC35-SCL家族蛋白調(diào)節(jié)的基因大部分重疊。綜上，擬南芥SRPKIIs特異性地影響SR蛋白亞類的磷酸化狀態(tài)，調(diào)節(jié)FLC的表達和選擇性剪接以控制開花時間。

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