qPCR簡(jiǎn)介

qPCR全稱Real-time Quantitative PCR，即實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。qPCR利用熒光染料或熒光探針標(biāo)記雙鏈DNA分子，因此能在DNA擴(kuò)增過程中，通過熒光量積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程中核酸擴(kuò)增產(chǎn)物含量的變化，之后利用數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系對(duì)熒光量積累結(jié)果分析，獲得待測(cè)樣品中靶基因的含量。

qPCR的原理

PCR是一種鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即每次擴(kuò)增后的產(chǎn)物可作為下次擴(kuò)增的底物，而在qPCR中，每次擴(kuò)增后產(chǎn)物的含量均可以通過對(duì)應(yīng)的熒光量表示，因此可通過設(shè)定一個(gè)熒光量閾值，統(tǒng)計(jì)達(dá)到該閾值所對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增數(shù)（循環(huán)數(shù)，Ct值），來計(jì)算待測(cè)樣品中靶基因的含量。待測(cè)樣品中靶基因的含量（拷貝數(shù)）越高，達(dá)到閾值所對(duì)應(yīng)Ct值越小，反之，待測(cè)樣品中靶基因的拷貝數(shù)越低，達(dá)到閾值所對(duì)應(yīng)Ct值越大。因此利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)代表Ct值，縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，利用獲得待測(cè)樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品中靶基因的拷貝數(shù)。

在實(shí)際的應(yīng)用中，為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，通常會(huì)在qPCR中添加內(nèi)參基因，通過對(duì)比內(nèi)參基因與靶標(biāo)基因的Ct值，可以將靶基因的表達(dá)水平歸一化，便于后續(xù)比較不同處理下基因表達(dá)量的變化，或表征不同基因在特定實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)水平。