RIP/Clip/MeRIP/ChRIP-seq等基于免疫沉淀的技術，是研究RNA與其它生物分子互作最常見的方法，這些方法一般是用特異抗體拉下與RBP（RNA結合蛋白）結合的RNA或者具有特定修飾的RNA或RNA:DNA雜合鏈，然后再將回收純化后的樣本進行建庫和測序。盡管這些技術已經很成熟，但是過程相當?shù)膹碗s和繁瑣。

近期 Steve Henikoff? 團隊在Nature Methods上介紹了一種名為逆轉錄和標記 (RT&Tag)的方法，能夠簡單快速的研究RNA蛋白互作及RNA修飾，未來有望取代傳統(tǒng)技術【1】。

逆轉錄和標記 (RT&Tag)的方法首先利用抗體將Oligo(dT)-Adapter-B復合物綁定到目的蛋白附近， 然后偶聯(lián)了Adapter-A的pA-Tn5轉座體結合到抗體上，加入逆轉錄酶后，Oligo(dT)-Adapter-B作為引物在RNA的3‘端逆轉錄產生 RNA/cDNA 雜合鏈，隨后Tn5 轉座酶識別RNA/cDNA雜合鏈，打斷后插入Adapter-A用于下游PCR擴增（圖1）。

圖1：RT&Tag技術原理流程

在雄性果蠅S2細胞系中使用MSL2抗體進行了RT&Tag實驗，文庫片段大小分布主要從200 bp—1000 bp，沒有核小體倍數(shù)模式。reads主要來自外顯子（66%），有少量的內含子（16%）和基因間區(qū)（18%），大多落在基因的3’端，與Oligo(dT)引物從成熟轉錄本的poly-A尾啟動一致。

和以發(fā)表的RIP-seq數(shù)據(jù)相比較，RT&Tag也能夠在S2細胞中識別MLE和roX2之間的相互作用，只需10萬個細胞，測試深度減少4倍（圖2）。

圖2：RNA結合蛋白MSL2-RT&Tag數(shù)據(jù)分析結果

Polycomb結構域是染色質的大區(qū)域，具有抑制性組蛋白H3K27me3標記，現(xiàn)有的一些研究表明，RNA參與了該區(qū)域的建立和維持。

以H3K27me3抗體進行RT&Tag，鑒定出1342個差異富集的轉錄本，其中1178個是蛋白編碼基因，GO功能分析與Polycomb通路相關，同時這些靶基因上有更高的H3K27me3-CUT&Tag信號。然后，評估了在10萬、2.5萬及5千個細胞中RT&Tag均能成功富集到H3K27me修飾的靶基因。

圖3：H3K27me3-RT&Tag數(shù)據(jù)分析結果

圖4：m6A-RT&Tag數(shù)據(jù)分析結果

RT&Tag技術相較于傳統(tǒng)免疫沉淀方法有很多優(yōu)勢，如只需要10萬個細胞；測序深度4-8百萬reads；可以應用于任何具有可用抗體的研究；直接打斷RNA/DNA雜合鏈，不需要純化核酸等。

原位抗體連接和標記使得RT&Tag可以滿足染色質結合RNA、RBP-RNA相互作用及m6A修飾RNA的高通量分析的需要，特別是當樣本輸入受到限制時，如臨床樣本或胚胎細胞，提供了一個更加全能和更好的的研究工具。

文獻引用：

1.Khyzha, Nadiya, Steven Henikoff, and Kami Ahmad. "Profiling RNA at chromatin targets in situ by antibody-targeted tagmentation." Nature Methods (2022): 1-10.