本文主要從以下四個(gè)方面，1. 色譜柱柱壓 2. 色譜峰峰形 3 . 色譜峰保留值 4 . 色譜柱柱壽命概述如何排除故障。

一、色譜柱柱壓

1、柱壓高多少正常？

同一條件：新色譜柱，C18，5μm，球形，4.6×250mm，100%甲醇，1mL/min，25℃，管路內(nèi)徑0.3mm（0.010″），通常:＜7MPa。

如果柱壓高了，先確認(rèn)出壓力升高的組件，有可能是色譜柱也可能是其他組件的原因。色譜柱污染、填料堵塞、篩板堵塞都會(huì)造成壓力升高。

2、確定壓力升高來源？

保護(hù)柱-卸下保護(hù)柱，儀器堵塞-卸下色譜柱，色譜柱進(jìn)口端堵塞-反方向測(cè)試（不是反沖！?。┤绻巧V柱引起的柱壓升高，問題是……

3、沖洗色譜柱

反相色譜柱（C18,C8）

按照以下方式?jīng)_洗：

a、 水/乙腈95/5→0/100

b、

如果不行，可在異丙醇里加1%TFA.

使用己烷或二氯甲烷沖洗色譜柱，在重新使用反相流動(dòng)相以前，必須用異丙醇過渡！正相色譜柱（SiO2.Diol），以下溶劑至少各50ml沖洗色譜柱:

原則：使用比MP更強(qiáng)的溶劑沖洗二氯甲烷>丙醇>四氫呋喃>乙醇>乙腈>甲醇>水。那么沖洗色譜柱 一定正確嗎？

C18柱上蛋白的沖洗： 是DMSO而不是THF?。?/p>

C18柱上淀粉的沖洗： 是水而不是甲醇！！

根據(jù)強(qiáng)保留污染物性質(zhì)，選擇合適的沖洗溶劑和程序！！

4、沖洗篩板

強(qiáng)溶劑、反方向、低流速。

反相色譜柱：水/乙腈95/5→0/100

正相色譜柱：

50%甲醇＋50%三氯甲烷→ 100%乙酸乙酯

－沖洗篩板不要連接檢測(cè)器

－不建議用戶自行更換篩板

5、預(yù)防柱壓過高

a、使用保護(hù)柱

b、樣品前處理（重點(diǎn)討論樣品類型）

c、經(jīng)常沖洗色譜柱

d、過濾流動(dòng)相

e、緩沖液或水不要保存過長(zhǎng)時(shí)間

6、樣品基質(zhì)如何去除 ？

制劑：淀粉、硅膠、其他添加劑

中藥：強(qiáng)疏水性成分

二、色譜峰峰形

常見以下幾種情況：色譜峰拖尾、色譜峰分裂、色譜峰擴(kuò)展，許多色譜峰峰形問題都是復(fù)合型問題， 造成色譜峰擴(kuò)展和柱效降低；色譜峰擴(kuò)展和拖尾或拖尾隨保留加劇。從以下幾個(gè)方面色譜柱問題、溶劑效應(yīng)、進(jìn)樣量（過載）、樣品的特性、柱外效應(yīng)來分析。

1、色譜柱問題

污物在柱進(jìn)口處積聚－強(qiáng)溶劑沖洗柱子

二次保留效應(yīng)－加入掃尾劑,10mM的TEA

重金屬污染－使用高純硅膠基質(zhì)色譜柱

對(duì)于難溶解的物質(zhì)：小體積強(qiáng)溶劑溶解以后用MP稀釋，掃尾劑：30mM的TEA（B性化合物），醋酸胺（A性化合物）

二次效應(yīng)

不加TEA 10mM的TEA

ASB C18,4.6×150mm，5μm，85% 25mM NaH2Na，15%ACN 1mL/min, 35℃

硅膠純度

初始的硅膠基質(zhì)，酸洗后的硅膠基質(zhì)，流動(dòng)相：20mM三甲胺

金屬污染C18硅膠造成的堿性藥物的拖尾

2、柱外效應(yīng)

色譜柱：150×0.45mm, 硅膠柱

流動(dòng)相：Hexane-CAN(99:1,V/V)

流 速：2.0mL/min

(a) 10μL進(jìn)樣閥與8μL檢測(cè)器流，通池的商品色譜儀

(b) 0.5μL進(jìn)樣閥與1μL檢測(cè)器流通池的商品色譜儀

柱外效應(yīng)造成的色譜峰拖尾

3、溶劑效應(yīng)

樣品進(jìn)樣過程的溶劑效應(yīng)（液相與質(zhì)譜）

樣品體積：30μL

流 動(dòng) 相：18% 乙腈-H2O

分別以純乙腈和流動(dòng)相為溶劑注 入咖啡因（A峰）與水揚(yáng)酸胺（B峰）樣品

解決方法：

1、使用流動(dòng)相溶解樣品

2、加大濃度，降低進(jìn)樣量

樣品溶劑進(jìn)樣的影響

4、樣品特性

葡萄糖端基異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化— 兩個(gè)峰

提高溫度，或提高pH值，轉(zhuǎn)化加快 一個(gè)峰

色譜柱：Venusil HILIC 5μm 4.6×250mm；流動(dòng)相：乙腈－水 (80: 20)；柱溫：30℃ ；檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；樣品：葡萄糖對(duì)照品水溶液，流速：1mL/min

5、柱外效應(yīng)對(duì)峰形/分離度的影響

死體積是指從進(jìn)樣器到檢測(cè)器的體積，這一段沒有被色譜填料所填充的部分，死體積大，會(huì)導(dǎo)致峰展寬，峰形變差等等。

6、柱外效應(yīng)對(duì)峰形/分離度的影響

盡量減小連接管路體積。尤其使用窄徑柱時(shí)！

柱后和檢測(cè)器之間標(biāo)配一個(gè)兩道，去掉后測(cè)試明顯改善

7、柱外效應(yīng)主要影響N值

進(jìn)樣量大主要引起柱子超載，保留時(shí)間和N值下降，一般憑經(jīng)驗(yàn)找到是保留時(shí)間和N最大的進(jìn)樣量。一般：0.46mm的色譜柱最大進(jìn)樣量為10-50ug。一般開始時(shí)大樣品量進(jìn)樣（10-50ug），然后逐漸降低進(jìn)樣量直至保留時(shí)間穩(wěn)定。

8、色譜峰拖尾/擴(kuò)展/分裂

色譜柱污染：復(fù)雜樣品基體或待測(cè)樣品量大

顆粒物堵塞篩板：復(fù)雜樣品基體或待測(cè)樣品量大

色譜柱死體積：流動(dòng)相pH>7時(shí)，硅膠溶解(除非使用特殊色譜柱)，死體積增加。

樣品溶劑效應(yīng)：樣品溶劑強(qiáng)于流動(dòng)相-裂分峰和擴(kuò)展峰取決于樣品量

三 . 色譜峰保留值

1、保留時(shí)間變化

漂移（單方向增加或減小 ）波動(dòng)（無規(guī)律的變化）

2、保留時(shí)間變化原因

色譜柱平衡、固定相變化、色譜柱污染、流動(dòng)相組成發(fā)生變化、疏水坍塌

3、色譜柱平衡

流動(dòng)相變化（梯度洗脫的平衡）、溫度變化、流速變化、更換色譜柱

至少使用10-20倍柱體積流動(dòng)相平衡色譜柱

4、固定相變化

鍵合相流失：通常保留時(shí)間變短，使用耐酸色譜柱：venusil ASB C18和C8系列

硅膠溶解：裂峰，使用耐堿的色譜柱：Durashell C18 ，RP

5、色譜柱污染

清洗：合適的清洗方式

使用保護(hù)柱：請(qǐng)?zhí)貏e注意何時(shí)更換保護(hù)柱、壓力、分離效果、時(shí)間、進(jìn)樣次數(shù)幾個(gè)方面。

6、流動(dòng)相組成發(fā)生變化

易揮發(fā)性組分揮發(fā)：夏天，注意密閉容器，不建議循環(huán)使用流動(dòng)相一相小于10%的在線混合正確配置流動(dòng)相（V:V）

7、疏水坍塌

C18色譜柱，若沒有指明，不得使用100%水作為流動(dòng)相 （至少含有5%的有機(jī)相）使用親水色譜柱（若水相必須大于95%）：Venusil MP C18、Venusil HLP、Venusil ASB C18，C8

8、建立良好重現(xiàn)性方法

選用質(zhì)量好的色譜柱、 選用良好的流動(dòng)相體系、用流動(dòng)相充分平衡柱子（如MP中含THF，三乙基胺或四丁基銨等胺類調(diào)節(jié)劑或離子對(duì)試劑，特別是烷基上有十個(gè)以上的碳原子的情況?。?、 采用合適的試驗(yàn)技術(shù)，確保日間穩(wěn)定、 預(yù)存色譜柱

四. 色譜柱柱壽命

1、色譜柱的壽命應(yīng)有多長(zhǎng)

a、操作者對(duì)色譜柱的使用和處理

b、注入樣品的類型

c、干凈樣品：進(jìn)樣至少2000次。

保證良好柱壽命與性能的方法

總體來說色譜柱常見問題癥狀是柱壓過高、峰形不好、保留時(shí)間不穩(wěn)。一般來說色譜柱常見問題原因如下：

色譜柱篩板問題－篩板或柱床部分堵塞；

強(qiáng)保留的樣品組分－吸附樣品雜質(zhì)（污物）；

色譜柱填充不好；

柱壓?jiǎn)栴}－機(jī)械或熱沖擊造成空洞

化學(xué)影響－基質(zhì)或鍵合相被化學(xué)侵蝕

有時(shí)此類問題并非由色譜柱引起，而是儀器和實(shí)驗(yàn)條件！