寫在前面

????????今天推薦的是由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院在2021年3月15日發(fā)表于Frontiers in Cell and Developmental Biology（2020IF：6.6840，JCRQ1/Q2）的一篇文章，通訊作者是Dan Wu教授，研究表明去泛素化酶USP21通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子GATA3結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)MAPK1表達(dá)以調(diào)節(jié)胃癌的腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞干細(xì)胞。

研究背景

????????胃癌（GC）作為消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，在許多亞洲國(guó)家仍然是十大癌癥相關(guān)死亡病例之一。USP21是一種參與多種癌癥惡性進(jìn)展的去泛素化酶，其在胃癌中的作用及具體分子機(jī)制尚不清楚。

摘要部分

????????本研究探討了USP21在體外和體內(nèi)的功能，并探討了USP21在體外GC中的調(diào)控機(jī)制。作者報(bào)道USP21在體外促進(jìn)GC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和干細(xì)胞，并在體內(nèi)調(diào)節(jié)小鼠的GC腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞干性。USP21通過(guò)與GATA3結(jié)合來(lái)穩(wěn)定GATA3的表達(dá)。此外，GATA3還在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)MAPK1的表達(dá)。一系列體外實(shí)驗(yàn)證明USP21通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子GATA3結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)MAPK1的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)GC的腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞干性。總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究確定了一個(gè)新的USP21/GATA3/MAPK1軸，它在促進(jìn)GC的惡性進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，并可能為治療提供潛在的靶點(diǎn)。

研究?jī)?nèi)容

1.USP21在GC組織和細(xì)胞中高度表達(dá)

????????作者使用TCGA-STAD數(shù)據(jù)集分析USP21在GC患者中的表達(dá)。與正常組織相比，USP21在GC組織中顯著高表達(dá)。作者進(jìn)行qRT-PCR以評(píng)估USP21在臨床GC組織和來(lái)自22名GC患者的鄰近正常組織中的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示USP21在GC組織中的表達(dá)明顯高于鄰近正常組織。與正常胃粘膜上皮細(xì)胞系相比，MGC-803顯著增加了USP21 mRNA，說(shuō)明了GC的腫瘤分級(jí)與USP21表達(dá)呈正相關(guān)的IHC結(jié)果。

研究結(jié)論：USP21可能在GC的惡性進(jìn)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

?

2.USP21促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和干細(xì)胞? ? ?

????????由于USP21在GC中的異常表達(dá)，選擇在分別具有相對(duì)低和高USP21表達(dá)的AGS和MKN-45細(xì)胞系進(jìn)行研究。作者通過(guò)USP21靶向質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞進(jìn)行過(guò)表達(dá)，而USP21 siRNA轉(zhuǎn)染MKN-45細(xì)胞進(jìn)行基因沉默。然后，通過(guò)qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染oe-USP21的AGS細(xì)胞中USP21的表達(dá)顯著增加，而轉(zhuǎn)染si-USP21的MKN-45細(xì)胞中USP21的表達(dá)顯著降低。為了檢測(cè)USP21對(duì)細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)行了MTT和集落形成試驗(yàn)。結(jié)果表明，USP21的過(guò)表達(dá)顯著提高了AGS細(xì)胞的生存力和集落形成能力，而抑制USP21的表達(dá)則顯著降低了MKN-45細(xì)胞的生存力和集落形成能力。隨后，通過(guò)Transwell試驗(yàn)評(píng)估USP21在細(xì)胞遷移和侵襲中的作用，USP21的過(guò)表達(dá)加速了AGS細(xì)胞的遷移和侵襲，而敲除USP21則顯著降低了AGS細(xì)胞的遷移和侵襲。MKN-45細(xì)胞。進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡以通過(guò)檢測(cè)幾種EMT標(biāo)記蛋白E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、α-連環(huán)蛋白和纖連蛋白的表達(dá)來(lái)測(cè)試USP21是否調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。觀察到AGS細(xì)胞oe-USP21組中E-cadherin和a-catenin顯著減少，而N-cadherin和纖連蛋白顯著增加。相反的結(jié)果出現(xiàn)在si-USP21組的MKN-45細(xì)胞中。

????????眾所周知，在非貼壁無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，CSCs可以完成自我更新，然后形成球體。為了進(jìn)一步確定USP21在CSC生長(zhǎng)和維持中的作用，研究了用oe-USP21處理的AGS細(xì)胞或用si-USP21處理的MKN-45細(xì)胞的球形成能力。用oe-USP21處理的AGS細(xì)胞的球形成能力顯著提高，而用si-USP21處理的MKN-45細(xì)胞的球形成能力受到抑制。

?研究結(jié)論：USP21刺激了GC細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和干性。

?

3.USP21可以在體外與GATA3相互作用? ? ?

????????先前的研究證明USP21可能參與癌癥的進(jìn)展。然而，關(guān)于USP21在GC中的作用是否與GATA3相關(guān)的報(bào)道很少。在這里，通過(guò)TCGASTAD中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)GATA3在GC中高度表達(dá)。進(jìn)行免疫沉淀以研究USP21是否與GATA3相互作用。將含有Flag-GATA3和Myc-USP21的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP21和Flag-GATA3共免疫沉淀。

研究結(jié)論：USP21和GATA3可以直接相互作用。

?

4.MAPK1是GATA3的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)

????????作者在hTFtarget數(shù)據(jù)庫(kù)上預(yù)測(cè)GATA3下游調(diào)控基因，并進(jìn)行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的靶基因主要富集于MAPK信號(hào)通路。進(jìn)一步提取富含MAPK信號(hào)通路的基因并進(jìn)行PPI分析。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)了PPI網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)基因的核心價(jià)值。發(fā)現(xiàn)MAPK1基因具有最高的核心值，表明MAPK1可能發(fā)揮了最重要的作用。在進(jìn)一步搜索TCGA-STAD數(shù)據(jù)集中MAPK1的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)MAPK1在GC組織中高表達(dá)。綜上所述，推測(cè)MAPK1可能是GATA3的下游目標(biāo)。為了驗(yàn)證上述預(yù)測(cè)，構(gòu)建了GATA3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒oe-GATA3和GATA3 siRNA（si-GATA3），分別轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞和MKN-45細(xì)胞。qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡表明GATA3的過(guò)表達(dá)顯著增加了MAPK1的表達(dá)，而GATA3的敲低顯著降低了MAPK1的表達(dá)。鑒于GATA3作為轉(zhuǎn)錄因子，GATA3和MAPK1在GC組織中均高度表達(dá)，推測(cè)GATA3可能直接促進(jìn)MAPK1轉(zhuǎn)錄。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，第一步是生成一個(gè)包含GATA3結(jié)合位點(diǎn)的MAPK1啟動(dòng)子，并使用定點(diǎn)誘變技術(shù)建立MAPK1突變。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果表明，GATA3的升高顯著增加了AGS細(xì)胞中MAPK1啟動(dòng)子的活性，而沉默的GATA3降低了MKN-45細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性，對(duì)兩者中MAPK1啟動(dòng)子的突變均無(wú)顯著影響。進(jìn)一步進(jìn)行ChIP測(cè)定以確定GATA3和MAPK1啟動(dòng)子之間的直接相互作用?？梢钥闯鲛D(zhuǎn)錄因子GATA3可以與MAPK1啟動(dòng)子相互作用以刺激MAPK1在GC細(xì)胞中的表達(dá)。

?研究結(jié)論：MAPK1是GATA3的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)。

?

5.USP21通過(guò)GATA3調(diào)控MAPK1的表達(dá)并影響細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和GC的干性

????????作者進(jìn)一步驗(yàn)證了USP21是否能通過(guò)GATA3/MAPK1軸發(fā)揮其對(duì)GC的致癌作用。通過(guò)qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析各組細(xì)胞中USP21、GATA3和MAPK1的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，MAPK1的表達(dá)隨著MAPK1的敲低而顯著降低，而USP21和GATA3的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。同時(shí)敲低MAPK1和過(guò)表達(dá)USP21可以顯著增加GATA3和MAPK1的表達(dá)，表明USP21可以通過(guò)GATA3調(diào)節(jié)MAPK1。測(cè)定各組細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)si-MAPK1可以抑制AGS細(xì)胞和MKN-45細(xì)胞的增殖，同時(shí)敲低MAPK1和過(guò)表達(dá)USP21可以逆轉(zhuǎn)si-MAPK1對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。進(jìn)行Transwell和蛋白質(zhì)印跡以評(píng)估AGS細(xì)胞和MKN-45細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、a-catenin和纖連蛋白，從而研究各組的細(xì)胞遷移和侵襲。敲低MAPK1后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降，細(xì)胞內(nèi)E-cadherin和a-catenin顯著增加，N-cadherin和纖連蛋白顯著下降，而USP21的過(guò)表達(dá)部分抑制了這些作用。此外，發(fā)現(xiàn)si-MAPK1顯著抑制AGS細(xì)胞和MKN-45細(xì)胞的球形成能力，但同時(shí)轉(zhuǎn)染si-MAPK1和oe-USP21顯著提高細(xì)胞的球形成能力。

研究結(jié)論：USP21通過(guò)GATA3調(diào)節(jié)MAPK1的表達(dá)，進(jìn)而影響GC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和干細(xì)胞。

?

6.USP21與體內(nèi)GC的腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞干性相關(guān)

????????建立小鼠異種移植模型以進(jìn)一步分析USP21對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。將過(guò)表達(dá)USP21的AGS細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)，然后檢測(cè)USP21在體內(nèi)的致瘤作用。與陰性對(duì)照組相比，USP21過(guò)表達(dá)組的腫瘤重量和體積顯著增加。此外， USP21的過(guò)表達(dá)顯著增加了CSC球體的比例。通過(guò)qRT-PCR評(píng)估CSC標(biāo)志物CD44和CD133在小鼠GC組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示USP21的過(guò)表達(dá)顯著提高了GC組織中CD44和CD133的表達(dá)水平，表明USP21的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了GC細(xì)胞的干性。還發(fā)現(xiàn)在oe-USP21組的腫瘤組織中，USP21、GATA3和MAPK1均顯著高表達(dá)。通過(guò)H&E染色和IHC評(píng)估裸鼠的細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)oe-USP21組的腫瘤中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組，而且腫瘤分級(jí)與Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量以及USP21的含量呈正相關(guān)。

研究結(jié)論：USP21在體內(nèi)調(diào)節(jié)GC的腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞干性。

?

結(jié)論與討論

????????該研究闡明了USP21作為癌基因促進(jìn)了GC的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和干性。在這項(xiàng)研究中突出的是USP21的這種致癌作用是通過(guò)GATA3/MAPK1軸介導(dǎo)?？傊?，本研究首次確立了USP21/GATA3/MAPK1軸在GC中的作用，為GC的病理功能提供了新的機(jī)制，對(duì)開發(fā)新的靶向治療具有潛在意義。

?

Thank you!

原文鏈接：

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.641981/full