研究思路

研究結果

1.?深層AML蛋白質組研究

作者運用LAML TCGA樣本集，從44個完全特征化的AML骨髓樣本中獲得了蛋白質提取物，這些樣本代表了廣泛的AML亞型，跨越了細胞遺傳風險、常見突變和驅動融合的范圍（圖1）。隨后對44名患者樣本以及3份健康對照骨髓樣本進行了label-free（LFQ）和TMT標記定量蛋白質組學研究。由于AML細胞含有豐富、高活性的絲氨酸蛋白酶，因此對樣品制備進行了優(yōu)化，加入了DFP蛋白酶抑制劑以避免蛋白水解。在TMT數據集中檢測到10651種蛋白質，在LFQ數據集中檢測到6845種蛋白質，總體上看蛋白質組學數據集的質量和可重復性都很高，為相關研究提供了可靠的蛋白數據庫參考。

圖1 | 研究中AML患者的特征和數據質量

2.?AML蛋白質組學前景的全球分析

作者根據TMT標記蛋白質組學平臺上測量的蛋白質豐度對樣品進行了無監(jiān)督的分層聚類，發(fā)現樣本主要由重要的臨床協(xié)變量組成，包括細胞遺傳學或常見突變（圖2A）。使用LFQ數據比較所有44個AML樣品中的總體蛋白質與RNA表達，看到了許多轉錄后調節(jié)的例子，其中RNA豐度不能預測蛋白質豐度（圖2B），比如組蛋白STMN2，AKT共激活因子/癌基因TCL1A和蛋白酪氨酸激酶受體KDR都顯示出與RNA表達不成比例的顯著增加的蛋白質豐度。與健康對照骨髓相比，AML樣品中多個蛋白質家族豐富，mRNA豐度沒有相應的變化，包括H/ACA盒小核仁核糖核蛋白核心復合物（參與mRNA34的端粒維持和假尿苷化）以及THO復合物（參與信使核糖核顆粒35的形成和輸出）。

圖2 | 蛋白表達水平通常與臨床特征相關，并揭示轉錄后調節(jié)的證據

3.?IDH1/2突變與KDM4A/B/C 組蛋白去甲基化酶豐度增加有關

作者對IDH1（n=5）或IDH2（n=4）突變患者與其他AML樣本（n=35）進行比較，篩選出17種差異豐度有差異的蛋白質（13種在IDH突變患者中豐度增加），并注意到2-氧戊二酸依賴性H3K9/27/36組蛋白去甲基化酶KDM4A，KDM4B和KDM4C36都受到類似的影響（圖3A）。在TMT數據集中，IDH1和IDH2突變的樣本普遍存在豐度增加的趨勢，但對IDH1的影響最強（圖3B）。盡管在靈敏度較低的LFQ數據集中對這些蛋白的檢測是有限的，但也出現了類似的趨勢，在IDH1和IDH2突變體樣本中，KDM4B的豐度明顯高于IDH1/2野生型（wt）樣本（在LFQ中，44個樣本中只有3個檢測到KDM4A，其中2個是IDH1/2突變體樣本；KDM4C沒有用LFQ檢測到）。但是在mRNA豐度上沒有看到明顯的變化，這表明KDM4A/B/C的蛋白豐度是在轉錄后水平上控制的。

圖3 | 具有IDH1/2突變的 AML 樣本與 KDM4A/B/C 組蛋白去甲基化酶豐度增加有關

4.?突變的NPMc蛋白與幾種核導入蛋白的豐度增加（以及與之的物理相互作用）有關

作者接下來確定了具有突變體NPM1的樣本中不同的蛋白質豐度。在這個數據集中，NPMc突變存在于8個案例中，并導致NPM1在細胞質中的異常錯位。比較發(fā)現NPMc突變體和NPM1野生樣本之間有11個差異豐度的蛋白質；8個蛋白上調，其中，2個屬于核導入蛋白家族的KPNA4和KPNB1（圖4A）。在核導入蛋白家族中，NPMc突變的AML樣本與健康的骨髓相比蛋白豐度更加明顯（圖4B）。在LFQ數據集中也有類似的（但沒有統(tǒng)計學意義）趨勢。在mRNA中沒有看到類似的趨勢（圖4C）。

為了確定這種轉錄后調控的潛在機制，作者運用TurboID系統(tǒng)，用生物素對緊密相關的蛋白質進行近距離標記，在原代小鼠造血細胞中對NPMc的特異性物理相互作用進行了篩選。該系統(tǒng)顯示與野生NPM1 TurboID融合相比，核導入蛋白KPNA3和KPNA4是NPMc的前30個生物素化蛋白之一，表明與突變體NPMc的物理接近（圖4D）。研究核導入蛋白，發(fā)現突變體NPMc TurboID構建體與KPNA1、KPNA3、KPNA4、KPNA6和KPNB1的相互作用根野生NPM1 TurboID載體相比明顯增加（圖4E）。在這種短暫的過度表達后，這些蛋白質的總豐度變化很?。▓D4F），表明標簽的增加是由于物理接近，而不是蛋白質豐度的增加。

圖4 | 有NPMc突變的AML樣本與幾種核導入蛋白的豐度增加有關，NPMc與幾個家族成員直接互動

5.?CD180和MRC1/CD206在AML細胞上表達，而不是正常的CD34細胞

因為細胞表面的AML特異性蛋白可以作為免疫療法的目標（例如，抗體-藥物結合物、雙特異性T細胞結合劑和/或嵌合抗原受體T細胞），于是在蛋白質組數據庫中對相關蛋白進行了檢索，將CD180和MRC1/CD206作為候選蛋白。

CD180是一個主要在B細胞上表達的Toll樣受體，參與激活信號的傳遞；它已被確定為治療B細胞非霍奇金淋巴瘤的候選靶標。發(fā)現CD180在許多AML樣本中高度表達，但在健康的CD34+富集的干細胞或健康骨髓中卻沒有表達（圖5A）。相應的RNA測序顯示，CD180主要在一些AML樣本和CD19+B細胞中表達，在較小程度上在單核細胞/巨噬細胞中表達（圖5B）。同樣，人類蛋白圖譜單細胞轉錄組學數據庫顯示，該蛋白主要在B細胞和巨噬細胞/單核細胞中表達，在其他地方表達極少。此外，選定的患者樣本和健康骨髓的流式細胞儀證實了CD180在AML細胞和CD19+B細胞上的表達，而在健康的CD34+干/祖細胞上沒有檢測到表達（圖5C-E）。

MRC1/CD206是一種甘露糖受體，主要表達在M2免疫抑制性巨噬細胞47和腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）的表面，這些巨噬細胞被認為會促進免疫抑制和促腫瘤的微環(huán)境。作者發(fā)現MRC1/CD206蛋白在AML樣本的一個亞群中高度表達，但在CD34+健康骨髓細胞中沒有表達（圖5F）。RNA的表達證實了在許多AML樣本中的高水平表達，在單核細胞中的表達較低，而在健康的CD34+細胞中的表達極少甚至沒有（圖5G）。

人類蛋白質圖譜單細胞轉錄組學數據庫顯示，該基因主要在巨噬細胞和肝星形細胞上表達。部分患者樣本的流式細胞儀證實MRC1/CD206確實在AML細胞和健康單核細胞上表達較高，但在健康CD34+細胞上沒有表達（圖5H-J）。綜上所述，這些數據表明，CD180和MRC1/CD206可能是針對AML的候選藥物，具有"靶向、非癌"等特征。

圖5 | CD180和MRC1在一些患者的AML血漿中高度表達，但在CD34干/祖細胞中不表達

6.?AML細胞的磷蛋白組學圖譜

作者對44個AML樣本和3個健康對照組中的磷酸化蛋白質組學進行了測定，總共檢測到5407個蛋白質、29201個磷酸化位點?；诹椎鞍捉M圖譜對患者進行無監(jiān)督聚類，發(fā)現AML和健康對照組之間有明顯的分離，同時發(fā)現了與激活的FLT3突變、PML-RARA融合（急性早幼粒細胞白血病[APL]）和CBFB-MYH11融合相對應的群體（圖6）。在對AML樣本與健康對照樣本的全面分析中，檢測到4個關鍵位點（PTPN11酪氨酸-542，PRKCD酪氨酸-313，PRF4B酪氨酸-849，和PDHA1酪氨酸-242；（圖7），還發(fā)現了STAT3信號增加與AML之間的聯系，加強了PRKCD激活的證據，并表明在AML細胞中通過PTPN11進行了廣泛的信號傳導。

隨后作者發(fā)現970個位點在AML樣本和健康對照之間有明顯的差異（圖7C），其中包括致癌性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT1上的2個激活位點（絲氨酸-124和絲氨酸-129）和DNMT3B上的多個位點（AML細胞中表達的2個新的甲基轉移酶之一；另一個是DNMT3A，AML中最頻繁突變的基因之一，圖7D）。

圖6 | AML樣本的磷蛋白組學分析揭示了與一些起始事件和FLT3突變的關聯

7.?FLT3-TKD突變與SRC-家族酪氨酸激酶FGR和HCK的激活有關

隨后作者觀察到與受體酪氨酸激酶FLT3的激活性酪氨酸激酶域（TKD）突變有關的強烈的磷酸化信號（圖6）。與FLT3正常樣本相比，FLT3-TKD樣本中有9個酪氨酸的磷酸化增加（圖7E）。其中包括HCK的激活位點酪氨酸-411和FGR的酪氨酸-34，兩者都是SRC家族的細胞質酪氨酸激酶（圖7F）。

還確定了PRKCD的激活位點酪氨酸-313，酪氨酸蛋白磷酸酶PTPN6上的激活位點酪氨酸-5（它在Src信號的失活中起作用），ρ/Rac鳥嘌呤核苷酸交換因子VAV1上的高度保守的酪氨酸-844位點（在中性粒細胞激活中處于HCK和FGR的下游），以及G6PD上的酪氨酸-401位點（被SRC家族激酶磷酸化時增加活性）。最后，作者發(fā)現ATP1A1上的酪氨酸-260的磷酸化增加，它可以調節(jié)SRC家族激酶的活性。數據表明，SRC家族激酶HCK和FGR，以及下游激酶PRKCD在含有FLT3-TKD突變的AML細胞中被激活。在4個含有FLT3-ITD突變的顯性亞克隆的樣本中，這些磷酸位點表現出許多類似的趨勢。

圖7 | 與特定突變相關的AML樣本的磷蛋白組學分析

8.?由PML-RARA啟動的AML顯示出一種磷蛋白組學特征

在由PML-RARA啟動的APL樣本中，作者確定了490個與其他AML樣本明顯不同的磷酸位點（圖7G），其中包括絲氨酸/蘇氨酸激酶STK26/MST4上的蘇氨酸-172位點，以及致癌轉錄因子JUN上的關鍵激活位點絲氨酸-63；在APL樣本中沒有檢測到STK26蛋白或JUN RNA（未檢測到JUN總蛋白）的明顯增加（圖7H）。

9.?TP53突變的AML顯示大量的TP53磷酸化和激活的FYN

在TP53突變的AML樣本中，有344個磷酸位點與其他AML明顯不同（圖7I），其中包括TP53本身的絲氨酸-183位點的磷酸化（標志著TP53的降解）和FYN酪氨酸激酶的激活位點酪氨酸-420；沒有發(fā)現TP53或FYN蛋白水平的顯著變化（圖7J）

研究討論

本研究從LAML TCGA數據集的44名有代表性急性髓系白血病（AML）患者和6個健康的骨髓來源對照組中開發(fā)了一個深度蛋白質組和磷酸化蛋白質組數據庫。這個數據集的富含大量蛋白信息，包括識別轉錄后調節(jié)的蛋白質豐度，識別AML免疫學目標的細胞表面標志物，以及與AML發(fā)病機制相關的信號通路的磷酸化變化信息，為后續(xù)的急性髓系白血病研究提供參考。

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