鄒博士本期的經(jīng)驗(yàn)分享將和大家聊一下在單細(xì)胞測(cè)序中臨床腫瘤樣本前處理的注意事項(xiàng)。對(duì)于臨床腫瘤樣本前處理的重要性和難度，相信所有做過(guò)單細(xì)胞測(cè)序研究的老師都深有體會(huì)?？偨Y(jié)前處理的各個(gè)細(xì)節(jié)，歸納起來(lái)包括影響樣本兩個(gè)屬性：

一是生物代表性，二是細(xì)胞活性。

生物代表性通俗的說(shuō)就是細(xì)胞成分對(duì)不對(duì)，用于做單細(xì)胞測(cè)序的細(xì)胞懸液，還是不是能代表最初在患者體內(nèi)的那塊腫瘤組織。

細(xì)胞活性通俗的說(shuō)就是細(xì)胞狀態(tài)好不好，能否拿到足夠數(shù)目的高活性的單細(xì)胞懸液，用于最終的檢測(cè)。

生物代表性和細(xì)胞活性，可以說(shuō)是一個(gè)單細(xì)胞研究項(xiàng)目最基礎(chǔ)最重要的要素之一。它直接決定了整個(gè)單細(xì)胞項(xiàng)目的數(shù)據(jù)質(zhì)量（穩(wěn)定性、檢測(cè)靈敏性，組間差異程度等等）。

下面我們從樣本獲取階段，單細(xì)胞懸液制備階段，懸液后處理階段三個(gè)階段細(xì)分，給大家分享下我們中科普瑞單細(xì)胞研究平臺(tái)在這方面的經(jīng)驗(yàn)：

一、臨床腫瘤樣本獲取階段

我們都知道臨床腫瘤樣本具有高度的異質(zhì)性，來(lái)自不同人的同一類(lèi)腫瘤的樣本，甚至是同一塊腫瘤組織的不同位置，它的細(xì)胞組成和基因表達(dá)譜都差異非常大。所以從臨床腫瘤樣本的獲取階段，就要開(kāi)始注意各種小的細(xì)節(jié)。通常的做法是對(duì)于實(shí)體腫瘤組織，隨機(jī)取其中的一小塊，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)際上根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，我們更推薦對(duì)于同一塊腫瘤組織，多點(diǎn)取樣，多點(diǎn)分別檢測(cè)，可以更有效的覆蓋整個(gè)組織的細(xì)胞成分異質(zhì)性。而如果因?yàn)橐恍┫拗埔蛩?，一個(gè)腫瘤組織只能取一個(gè)樣本，那就選擇取一個(gè)橫截面的片狀組織，可以更好地展現(xiàn)組織的細(xì)胞組成和基因表達(dá)譜的異質(zhì)性。

同樣，臨床腫瘤樣本的獲取階段，也有一些細(xì)節(jié)，有助于維持細(xì)胞的活性。

我們總結(jié)了下包括四個(gè)要點(diǎn)：干凈、鮮活、流程、快速

2? 干凈。比如要盡可能地用生理鹽水去除組織表面的血漬、液體、筋膜等雜質(zhì)，否則可能會(huì)對(duì)酶解或后續(xù)其他步驟有影響。

2? 鮮活。避免取到存在大量凋亡細(xì)胞的組織，例如切割的邊緣造成的焦黑組織。實(shí)體瘤核心區(qū)域往往因?yàn)槿鄙傺鯕夂宛B(yǎng)分而存在一定比例的細(xì)胞凋亡，也應(yīng)避免取到這一部分。否則注定了最后組織解離得到的細(xì)胞懸液活性不高。

2? 流程。對(duì)于手術(shù)中常規(guī)的一些操作，參考臨床客戶(hù)的一些經(jīng)驗(yàn)，也有一些可以注意的細(xì)節(jié)：比如針對(duì)要手術(shù)的組織器官，為了防止出血過(guò)多，首先是要暫停幾條主要的血供，這個(gè)過(guò)程可能就半小時(shí)過(guò)去了；在缺少血供的情況下再進(jìn)行下一步的手術(shù)，最后才能在組織上取一塊作為待檢測(cè)樣品，組織器官已經(jīng)缺血缺氧一段時(shí)間了，很可能細(xì)胞活性已經(jīng)受到了影響，是否可以考慮在操作規(guī)程允許的情況下，在斷血供盡量短的時(shí)間內(nèi)，取到樣品。還有例如手術(shù)過(guò)程中會(huì)頻繁涉及到所有事物的消毒（無(wú)論是擦拭或浸泡），都應(yīng)該避免對(duì)檢測(cè)物品做消毒處理。

2? 快速。手術(shù)過(guò)程中取得了樣品后，需要盡快放置到冰上低溫保存，并且盡快進(jìn)行運(yùn)輸和后續(xù)酶解操作。

二、單細(xì)胞懸液制備階段

在單細(xì)胞懸液制備階段核心原則就是“質(zhì)與量的取舍”。

?? “質(zhì)”就是細(xì)胞活性。解離時(shí)間越短，步驟越簡(jiǎn)單，細(xì)胞活性往往越好，但細(xì)胞數(shù)可能不夠多。

?? “量”就是細(xì)胞數(shù)目。解離時(shí)間越長(zhǎng)，過(guò)程越復(fù)雜，往往細(xì)胞得率越高，但是往往細(xì)胞活性會(huì)隨時(shí)間下降。

?? “取舍”就是找到一個(gè)平衡點(diǎn)，一個(gè)合適的時(shí)間窗口，能保證解離出足夠的細(xì)胞數(shù)，同時(shí)也不至于是細(xì)胞活性下降太多。常見(jiàn)時(shí)間是在30-60min不等。

另外不同的消化酶的底物不同，活性強(qiáng)弱也不同，所以常常針對(duì)不同種的臨床樣本，做酶解配方的選擇和酶解條件的調(diào)整。

以上這些酶解條件，推薦大家可以參考已發(fā)表的文獻(xiàn)，或者跟我們中科普瑞的技術(shù)人員溝通，獲得一些初步的經(jīng)驗(yàn)。

此外，在單細(xì)胞懸液制備階段，有一些細(xì)胞比較特殊。比如一些細(xì)胞特別敏感，很容易在組織解離過(guò)程中死亡的細(xì)胞?；蛘呒?xì)胞形態(tài)特殊，不能正常進(jìn)行單細(xì)胞捕獲的細(xì)胞。例如神經(jīng)元細(xì)胞，生殖相關(guān)細(xì)胞，心肌細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等等。針對(duì)這一些細(xì)胞，慢慢又發(fā)展出了提取細(xì)胞核，做單細(xì)胞核測(cè)序的實(shí)驗(yàn)方法。

單細(xì)胞核測(cè)序與單細(xì)胞測(cè)序各有優(yōu)缺點(diǎn)，目前應(yīng)用最廣泛的仍然單細(xì)胞測(cè)序，以下我們也總結(jié)了單細(xì)胞核測(cè)序的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，供大家參考：

單細(xì)胞核測(cè)序的優(yōu)勢(shì)：只需要常規(guī)的速凍保存操作，理論上細(xì)胞的狀態(tài)凍結(jié)在那一瞬間，避免了在運(yùn)輸保存以及酶解過(guò)程中帶來(lái)的轉(zhuǎn)錄組應(yīng)激改變。并且細(xì)胞核普遍在10μm上下，對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞，卵母細(xì)胞，心肌細(xì)胞等特殊細(xì)胞類(lèi)型的捕獲，不受形態(tài)、大小限制。

單細(xì)胞核測(cè)序的劣勢(shì)：轉(zhuǎn)錄本數(shù)目減少，丟失了細(xì)胞漿的大量mRNA轉(zhuǎn)錄本。核內(nèi)并且大部分是不成熟的mRNA，帶有大量Intron，提高了定量分析的難度。并且單細(xì)胞核測(cè)序不利于免疫細(xì)胞的捕獲。

所以，要根據(jù)實(shí)際的情況（比如研究目的、樣本的狀態(tài)）做取舍，選擇使用單細(xì)胞測(cè)序還是單細(xì)胞核測(cè)序。

比如常規(guī)單細(xì)胞測(cè)序檢測(cè)神經(jīng)組織的結(jié)果，往往免疫細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞等占多數(shù)，神經(jīng)元幾乎檢測(cè)不到。而如果改用單細(xì)胞核測(cè)序，那可能檢測(cè)結(jié)果中90%以上是神經(jīng)元細(xì)胞核，其他細(xì)胞類(lèi)型大大減少。所以就要根據(jù)您的研究目的來(lái)決定到底用單細(xì)胞測(cè)序還是單細(xì)胞核測(cè)序。

三、懸液后處理階段

在懸液后處理階段，這包括我們大家都比較熟悉的一些實(shí)驗(yàn)方法和步驟，例如流式或磁珠分選，紅細(xì)胞裂解，死細(xì)胞去除等等。

這些方法都是針對(duì)細(xì)胞懸液做的一些后處理，以使其滿(mǎn)足我們的研究目的和單細(xì)胞測(cè)序的質(zhì)控要求。但這些后處理操作往往也是雙刃劍。

后處理的優(yōu)勢(shì)：對(duì)感興趣的目的細(xì)胞起到了富集作用，并排除了不想要的細(xì)胞（紅細(xì)胞、死細(xì)胞等等），同時(shí)也去除了細(xì)胞懸液中的碎片，雜質(zhì)。

后處理的劣勢(shì)：失去了細(xì)胞懸液原本的細(xì)胞類(lèi)型的比例信息。同時(shí)增加了額外步驟，延長(zhǎng)了操作時(shí)間，可能造成細(xì)胞活性的進(jìn)一步下降。

我們建議您要根據(jù)實(shí)際的情況（比如研究目的、樣本的狀態(tài)）做取舍。

2? 如果只想研究某一種特定的細(xì)胞類(lèi)型，并且它的比例在初始細(xì)胞懸液中的比例非常低（不超過(guò)5%），那肯定要通過(guò)后處理，富集到希望研究的細(xì)胞類(lèi)型。

2? 如果除了想研究的特定細(xì)胞類(lèi)型，但也希望不丟掉其他細(xì)胞類(lèi)型的特征信息，以及微環(huán)境的細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)等信息，那要么不做后處理，保留所有細(xì)胞，要么做完后處理，同時(shí)保留兩個(gè)組分的細(xì)胞（比如CD45陰選，除了檢測(cè)非免疫細(xì)胞之外，免疫細(xì)胞不扔掉，也平行做檢測(cè)，最后分析時(shí)放在一起分析，這樣既能研究目的細(xì)胞，又能兼顧其他細(xì)胞）。

BD-中科普瑞單細(xì)胞研究聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)多年的技術(shù)積累，已完成樣本數(shù)千例，協(xié)助客戶(hù)發(fā)表SCI論文數(shù)十篇，擁有豐富的樣本前處理和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，如果大家有任何問(wèn)題，歡迎您隨時(shí)聯(lián)系我們來(lái)幫助您解決單細(xì)胞測(cè)序研究中的各種技術(shù)問(wèn)題！

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