? ? ? ? 今天要講的這篇文獻是2023年5月在cell reports上發(fā)表的一篇文章，名字是CX3CR1hi macrophages sustain metabolic adaptation by relieving adipose-derived stem cell senescence in visceral adipose tissue。

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? ? ? ?我們都知道在短期營養(yǎng)過剩時，脂肪細胞可以通過增生或肥大完成適應性擴張，儲存更多的甘油三酯。ASC是脂肪組織內(nèi)的干細胞，可以支持脂肪組織的增生適應。如果ASC發(fā)生衰老，細胞周期被阻滯，一定會影響到ASC的增生能力，從而影響脂肪組織適應性擴張的能力。所以ASC在短期營養(yǎng)供應過剩時保持活性，是脂肪組織能夠順利適應性擴張的前提。但是ASC如何在營養(yǎng)過剩期間減少細胞衰老的機制還不清楚。這篇文章就提出了自己的猜想，他們認為這個過程與巨噬細胞有關。

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? ? ? ?他們首先通過流式檢測了脂肪組織內(nèi)巨噬細胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)相較于SAT，VAT內(nèi)的巨噬細胞數(shù)量，不論是在SVF總體還是在免疫細胞中的占比都更高。因為無論是新生鼠還是老年鼠，它們VAT內(nèi)Ki67的信號都不強，也就是說VAT中巨噬細胞是因為細胞增殖才增多的，而更有可能是因為VAT會分泌更多的巨噬細胞趨化因子。通過分析數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)相較于SAT，VAT中巨噬細胞趨化因子MCP-1 mRNA數(shù)量更高，并且分析發(fā)現(xiàn)在VAT中巨噬細胞數(shù)量與MCP-1的含量存在正比關系，他們自己的實驗結(jié)果也顯示出VAT-SVF內(nèi)MCP-1和巨噬細胞數(shù)量都更多，并且存在正相關。也就是說VAT會分泌更多的MCP-1吸引巨噬細胞。更準確一點來說，是VAT內(nèi)SVF部分的ASC會分泌更多的MCP-1。

? ? ? ? 為了驗證這種說法，他們進行了細胞遷移實驗，將VAT-ASC培養(yǎng)在下方，24h后在上方加入巨噬細胞，6h后進行結(jié)晶紫染色。結(jié)果顯示，相較于SAT-ASC，VAT-ASC對巨噬細胞的吸引作用更強，并且這種吸引作用在添加MCP-1抗體之后會減低。另外補充實驗添加了MCP-1受體CCR2的阻斷劑，結(jié)果也是同樣的會減低ASC對巨噬細胞的吸引作用。

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? ? ? ?但是ASC吸引巨噬細胞聚集到VAT的作用是什么呢？所以他們使用clophosome耗竭脂肪組織的巨噬細胞，觀察在短期營養(yǎng)過剩時巨噬細胞的作用。他們的實驗中短期高脂喂養(yǎng)選擇的是3周，就像前面提到的在這個時長內(nèi)脂肪組織還可以進行適應性擴張，還處于機體可以調(diào)節(jié)的范圍內(nèi)。結(jié)果顯示，無論是正常喂食還是高脂喂食，在清除掉巨噬細胞之后，小鼠的體重都不能正常升高，VAT質(zhì)量與體重的比值也相對較低，這說明巨噬細胞減少之后VAT的正常擴張受到了影響。另外在清除掉巨噬細胞之后，高脂喂養(yǎng)的小鼠出現(xiàn)了糖耐量降低。

? ? ? ?前面提到VAT的正常擴張與脂肪組織的衰老程度有關，所以他們對四組小鼠的VAT進行了βgal染色，結(jié)果顯示清除掉巨噬細胞的小鼠VAT衰老更嚴重，并且脂肪細胞也出現(xiàn)異常肥大。他們檢測了脂肪增生的相關基因，其中PPAR-γ還做了WB實驗，結(jié)果都顯示VAT內(nèi)的巨噬細胞清除之后影響到了VAT內(nèi)的脂肪生成。

? ? ? ? 實驗結(jié)果還顯示，在清除掉巨噬細胞之后，VAT內(nèi)ASC的衰老更嚴重，ASC的數(shù)量也下降。也就是說，在ASC分泌MCP-1吸引巨噬細胞的同時，巨噬細胞也會反過來抑制ASC的衰老。

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? ? ? ?另外他們還發(fā)現(xiàn)，使用clophosome清除掉的巨噬細胞有很多是CX3CR1表型，而CX3CR1高表達巨噬細胞的數(shù)量與ASC的數(shù)量也是正相關的關系。這似乎說明巨噬細胞高表達CX3CR1與巨噬細胞抑制ASC衰老有關。

? ? ? ?為了驗證這個猜想，他們構(gòu)建了VAT-ASC和巨噬細胞共培養(yǎng)的模型，結(jié)果顯示共培養(yǎng)處理后，共培養(yǎng)環(huán)境中的ASC衰老程度減低，共培養(yǎng)系統(tǒng)中的巨噬細胞高表達出了CCR2、CX3CR1、Arg1。CCR2前面說到了是MCP-1的受體。共培養(yǎng)促進巨噬細胞高表達CX3CR1，這個后面會提到，是ASC通過分泌外泌體實現(xiàn)的。在共培養(yǎng)環(huán)境中分別沉默巨噬細胞內(nèi)的CX3CR1和Arg1，會發(fā)現(xiàn)ASC的衰老程度增加。另外他們發(fā)現(xiàn)，沉默CX3CR1會使Arg1 mRNA數(shù)量降低，而沉默Arg1卻會使CX3CR1 mRNA數(shù)量升高，也就是說可以初步建立起一個上下游關系，CX3CR1會作用于Arg1從而對ASC發(fā)揮作用。

? ? ? 在體內(nèi)，精氨酸會在Arg1的作用下轉(zhuǎn)化為鳥氨酸，鳥氨酸又會轉(zhuǎn)化為腐胺和亞精胺，亞精胺會作用于eIF5A使eIF5A hypusination化，hypusination化的eIF5A會增強氧化磷酸化和細胞自噬。我們都知道如果細胞自噬增強的話細胞衰老是會在一定程度上緩解的。

? ? ? ?于是他們檢測了ASC中這條軸上的相關蛋白，發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞存在的時候，ASC中eIF5A hypusination化程度增強，細胞自噬增強，細胞衰老減輕。并且使用GC7抑制eIF5A hypusination化，或者沉默eIF5A基因，ASC的衰老程度增強。

? ? ? ?前面我們提到了ASC會通過外泌體使巨噬細胞CX3CR1表達增多，這些就是針對這個猜想的實驗結(jié)果。結(jié)果顯示，當巨噬細胞單獨被ASC外泌體孵育時，巨噬細胞內(nèi)CX3CR1和Arg1表達升高，高表達CX3CR1和Arg1的巨噬細胞數(shù)量增多。如果使用抑制外泌體生成的GW4869預處理ASC后再與巨噬細胞共培養(yǎng)，巨噬細胞內(nèi)CX3CR1和eIF5A的表達不再升高，巨噬細胞對ASC衰老的抑制作用也減退。如果在ASC和巨噬細胞共培養(yǎng)環(huán)境中加入額外的外泌體，ASC的衰老程度更加下降。

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? ? ? ? 總而言之，在短期能量供應過剩時，ASC會分泌MCP-1吸引巨噬細胞聚集在VAT中，并且會分泌外泌體使巨噬細胞表現(xiàn)出CX3CR1高表達的表型。同時CX3CR1高表達的巨噬細胞又會通過Arg1-多胺-eIF5A hypusination軸減少ASC的衰老，從而保證脂肪組織的適應性擴張能力。但是如果高脂喂養(yǎng)時間延長，血液中的LPS含量會升高，它會攻擊VAT-ASC，并且促進ASC釋放TNF-α，他們認為TNF-α的存在會抑制巨噬細胞高表達CX3CR1，從而使短期能量供應時ASC和巨噬細胞的相互促進的循環(huán)崩潰。

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? ? ? ? 為了驗證這個猜想，他們使用LPS預處理了VAT-ASC，再將巨噬細胞加入進行共培養(yǎng)，結(jié)果顯示此時再共培養(yǎng)確實會抑制巨噬細胞表達CX3CR1、Arg1，巨噬細胞的存在也沒有辦法減輕ASC的衰老，并且ASC確實會分泌更多的TNF-α。所以他們在共培養(yǎng)環(huán)境中加入TNF-α的抗體，結(jié)果顯示消除TNF-α的影響后，LPS對巨噬細胞表達CX3CR1和Arg1的抑制作用也同樣消失，ASC的衰老程度也減輕。

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? ? ? ?接著他們思考既然高脂喂養(yǎng)會使ASC和巨噬細胞之間的循環(huán)崩潰，那如果在長期高脂喂養(yǎng)時在機體內(nèi)轉(zhuǎn)移進CX3CR1高表達的巨噬細胞，能不能達到重建循環(huán)，減輕ASC的衰老。他們對小鼠進行了19周的高脂喂養(yǎng)，在喂養(yǎng)的最后3周將高表達CX3CR1的巨噬細胞在外泌體孵育后轉(zhuǎn)移入小鼠體內(nèi)。這些巨噬細胞加入了DiD標簽，可以通過活體成像觀察巨噬細胞在VAT內(nèi)聚集的程度。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移的巨噬細胞更多的富集在VAT中，盡管肝臟上也有信號，但是它的強度相對于VAT內(nèi)更弱，所以他們認為可忽略不計。盡管轉(zhuǎn)移了CX3CR1高表達的巨噬細胞并不影響高脂喂養(yǎng)小鼠的體重，但是小鼠的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗有所緩解，脂肪細胞也沒有過分肥大，脂肪組織內(nèi)ASC的衰老水平下降，ASC的數(shù)量也增多。脂肪增生程度升高，細胞自噬增強。除此以外他們還發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移了高表達CX3CR1巨噬細胞之后，脂肪組織內(nèi)與褐色脂肪組織生成相關的基因表達增加，他們可以觀測到小鼠的體溫升高，能量消耗增多，氧氣消耗和二氧化碳生成增多，換氣比值升高。

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? ? ? ?既然已經(jīng)知道了轉(zhuǎn)移高表達的CX3CR1巨噬細胞可以達到改善代謝的作用，那如果降低CX3CR1的表達程度會不會對改善作用有影響。所以他們分別從CX3CR1雜合的鼠和CX3CR1缺失純合鼠體內(nèi)分離出巨噬細胞，在外泌體孵育之后將這些巨噬細胞轉(zhuǎn)移進長期高脂喂養(yǎng)的小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示它們的體重依舊沒有太大變化，移入CX3CR1雜合巨噬細胞的小鼠葡萄糖不耐受和胰島素抵抗得到適當?shù)木徑?，ASC的衰老程度也適當減輕，但是緩解程度明顯沒有高表達CX3CR1巨噬細胞強，這可能就是因為雜合巨噬細胞內(nèi)CX3CR1的表達程度有限。CX3CR1缺失純合的巨噬細胞對于高脂喂養(yǎng)的小鼠則沒有什么作用。另外他們發(fā)現(xiàn)CX3CR1雜合巨噬細胞的轉(zhuǎn)移可以適當恢復脂肪組織內(nèi)CX3CR1高表達巨噬細胞的數(shù)量，適當恢復ASC的數(shù)量。

? ? ? ? 最后他們進行了額外實驗去探索CX3CR1如何影響Arg1。首先知道Stat3的激活與Arg1的活性有關，所以他們檢測了CX3CR1雜合和CX3CR1缺失純合的巨噬細胞內(nèi)的p-Stat3和Arg1的表達水平，結(jié)果顯示CX3CR1確實通過激活Stat3作用于Arg1，他們還沉默了巨噬細胞內(nèi)的CX3CR1也得到了同樣的結(jié)果。因為CX3CR1是一種G蛋白耦聯(lián)受體，所以他們使用EGTA和BAPTA阻斷了鈣離子的轉(zhuǎn)移，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Stat3的激活作用和Arg1的表達水平也跟著下降。也就是說CX3CR1通過轉(zhuǎn)移鈣離子激活Stat3和Arg1。熒光結(jié)果也是這樣的。相對于CX3CR1缺失純合的巨噬細胞，CX3CR1雜合巨噬細胞內(nèi)表現(xiàn)出更密集的鈣離子信號。沉默了巨噬細胞內(nèi)的CX3CR1后細胞內(nèi)的鈣離子信號強度降低。使用外泌體增加CX3CR1表達后巨噬細胞內(nèi)的鈣離子信號又會增強。

? ? ? ? 總而言之，在短期高脂喂養(yǎng)時，VAT內(nèi)的ASC會釋放MCP-1吸引巨噬細胞，并且通過釋放外泌體使巨噬細胞表達出高水平的CX3CR1。巨噬細胞內(nèi)的CX3CR1通過轉(zhuǎn)移鈣離子激活Stat3，從而激活Arg1，通過Arg1-多胺-eIF5A hypusination軸使ASC細胞自噬增強、細胞衰老緩解，從而維持脂肪組織的正常增生能力。而在長期高脂喂養(yǎng)時這個相互作用會被破壞。但是對高脂喂養(yǎng)的個體轉(zhuǎn)移外源高表達CX3CR1巨噬細胞后這個相互作用又會得到恢復，并且機體脂肪組織表現(xiàn)出棕色化的趨勢。