2.11 細(xì)胞免疫檢測(cè)

2.11.1 脾細(xì)胞分離方法（實(shí)操版本）

在首次免疫后第14天及28天，每組隨機(jī)選取5只小鼠，解剖后采集脾臟，準(zhǔn)備進(jìn)行小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的分離。具體分離方法如下：

1)?脫頸處死小鼠后，將其浸泡在75%酒精溶液內(nèi)靜置10 min；

2)?在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)解剖小鼠，分離脾臟，盡可能去除干凈脾臟周?chē)窘M織；

3)?在小鼠淋巴細(xì)胞分離液中頓性研磨脾臟，經(jīng)70孔目細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。小心沿著管壁加入1 mL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液，使其覆蓋于分離液上層。水平離心機(jī) 2000 rpm/min 室溫離心 30 min；

4)?離心后的液體共分為4層，小心吸取上面第二層的淋巴細(xì)胞至新的15 mL離心管中。加入 5 mL 紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻后水平離心機(jī)1500 rpm/min室溫離心10 min；

5)?棄掉上清液，加入10 mL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液，水平離心機(jī)1500rpm/min室溫離心10 min；

6)?重復(fù)步驟5一次；

7)?棄掉上清液后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)后保存于含5% CO2的 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中備用。

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2.12 T淋巴細(xì)胞檢測(cè)

1.?取上一步驟中分離的各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞亞群數(shù)量，具體操作步驟如下：

2.?每只小鼠取1×106個(gè)脾臟淋巴細(xì)胞，3000 rpm/min室溫離心5 min；

3.?輕輕棄掉上清，加入500 ul 1×PBS緩沖液重懸細(xì)胞團(tuán)，3000 rpm/min室溫離心5 min；

4.?輕輕棄掉上清，加入100 ul 1×PBS緩沖液重懸細(xì)胞團(tuán)。按照流式抗體說(shuō)明書(shū)建議濃度及用量分別加入熒光抗體PerCP-Cy5.5 anti-mouse CD3、FITCanti-mouse CD4 和 PE anti-mouse CD8并充分混勻，而后置于 4℃冰箱避光孵育30min；

5.?3000 rpm/min室溫離心 5 min；

6.?在避光或弱光環(huán)境中，輕輕棄掉上清，加入500 ul 1 ×PBS緩沖液重懸細(xì)胞團(tuán)，3000 rpm/min 室溫離心5 min；

7.?重復(fù)步驟（5）一次；

8.?輕輕棄掉上清，加入500 ul 1×PBS 緩沖液重懸細(xì)胞團(tuán)，隨即轉(zhuǎn)移至流式管中，待上機(jī)檢測(cè)熒光信號(hào)；

9.?結(jié)果分析：利用Flowjo軟件分析10000個(gè)細(xì)胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+亞群數(shù)量，利用 GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與制圖。

備注：流式分析（107-5*107），盡可能多，24孔板（500ul)，滅活苗/5個(gè)孔（其中四個(gè)用于單染）。細(xì)胞刺激；若晚上分完細(xì)胞，可以明天一早刺激，刺激劑（PMA）加1ul，抑制劑（BFA）2ul用于流式分析的4-6h，收樣染色。

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2.13 酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫檢測(cè)（ELISA-Spot）

第一天：接種細(xì)胞，加入刺激物，培養(yǎng)（嚴(yán)格注意無(wú)菌操作）

1)?預(yù)包被板的活化：每孔加入200ul無(wú)血清培養(yǎng)基或者RPIM-1640培養(yǎng)基，室溫靜置5-10min分鐘后將其扣出。

2)?加入細(xì)胞懸液：將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液加入各試驗(yàn)孔，100ul/well。正對(duì)照孔：細(xì)胞濃度可采用1×105 cells/well；負(fù)對(duì)照孔：細(xì)胞濃度可采用1×105 cells/well；背景負(fù)對(duì)照：加入重懸細(xì)胞所用的培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)孔：樣品的細(xì)胞濃度由實(shí)驗(yàn)者根據(jù)實(shí)驗(yàn)自行調(diào)整。

3)?加入刺激物：10ul/well，具體如下：正對(duì)照孔加入陽(yáng)性刺激劑工作液。負(fù)對(duì)照孔（含背景負(fù)對(duì)照孔）：加入重懸細(xì)胞所用的培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)孔：加入實(shí)驗(yàn)者自己的刺激物（用無(wú)血清培養(yǎng)基或者RPMI1640配制成10×終濃度）。

4)?孵育：所有樣品和刺激物加完后，蓋好板蓋。放入37℃。5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16-24小時(shí)。

第二天：培養(yǎng)后操作（不在需要無(wú)菌操作）

1.?裂解細(xì)胞：傾倒孔內(nèi)細(xì)胞及培養(yǎng)基。加入冰冷的去離子水。200ul/well，4℃冰箱放置10分鐘低滲裂解細(xì)胞。

2.?洗板：甩出孔內(nèi)液體，加入1×Washing buffer，260ul/well，停留1分鐘后棄去孔內(nèi)液體，重復(fù)六次，每一次在吸水紙上扣干。

3.?檢測(cè)抗體孵育：將稀釋好的生物素標(biāo)記的抗體（Biotinylated antibody）工作液加入實(shí)驗(yàn)孔，100ul/well。37℃孵育1小時(shí)。

4.?洗板：重復(fù)步驟2。

5.?酶聯(lián)親和素孵育：將稀釋好的酶標(biāo)親和素（Streptavidin-HRP）工作液加入各實(shí)驗(yàn)孔，100ul/well。37℃孵育1小時(shí)。

6.?洗板：甩出孔內(nèi)液體，加入1×Washing buffer，260ul/well，停留1分鐘后棄去孔內(nèi)液體，重復(fù)五次，每一次在吸水紙上扣干，然后揭開(kāi)板底座，用去離子水/自來(lái)水洗滌膜底面及底座，用吸水紙小心吸干底座及膜殘留的水跡，合上底座，加入1×Washing buffer，260ul/well，停留1分鐘后棄去孔內(nèi)液體，徹底扣干孔內(nèi)液體。

7.?顯色：將現(xiàn)配的AEC顯色液加入各實(shí)驗(yàn)孔，100ul/well。室溫避光靜置5-30分鐘，根據(jù)斑點(diǎn)生成情況選擇終止顯色時(shí)間。若室溫低于20℃，建議在37℃孵箱做顯色，每隔5-10分鐘檢查一次。

8.?終止顯色：傾倒孔內(nèi)液體，揭開(kāi)板底座，用去離子水/自來(lái)水洗滌正反面及底座3-5遍，終止顯色。將板放置在室溫陰涼處，待自然晾干后合上底座。

9.?ELISPOT板斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù)，做統(tǒng)計(jì)分析。

10.?若不能及時(shí)讀板時(shí)，請(qǐng)將板條避光密封保存，盡量在一周內(nèi)讀板。

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2.14 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（CCK-8法）

1.?用1640完全培養(yǎng)基重懸分離的脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞濃度為2×106cells/ml；

2.?用1640完全培養(yǎng)基重懸分離的脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用細(xì)胞濃度為2×106cells/ml；

3.?每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)組別，即多肽刺激組，ConA刺激組和未刺激組，將上述淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（50ul/孔），分別加入50ul相應(yīng)的刺激物，多肽刺激組加入等量混合的肽，每種肽濃度為5ug/ml，ConA刺激組加入5ug/ml ConA的完全培養(yǎng)基。未刺激組加入50ul 1640完全培養(yǎng)基。于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育72h；

4.?待孵育完成后，每孔加入10ul CCK-8溶液，37℃避光放置3h，450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值；

5.?按照下面公式計(jì)算刺激指數(shù)SI=(OD樣品孔-OD空白孔）/(OD陰性孔-OD空白孔）或者刺激指數(shù)（SI）計(jì)算公式如下（刺激物刺激孔OD值-空白孔OD值）/未刺激對(duì)照孔OD值。

注意：96孔板最外側(cè)一圈加PBS，蒸發(fā)對(duì)結(jié)果有影響。

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2.15 血清細(xì)胞因子檢測(cè)（上海欣博盛公司試劑盒）

1.?從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條，未用的板條和干燥劑請(qǐng)放回鋁箔袋內(nèi)壓實(shí)自封條，密封口袋，放回4 C。

2.?空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本通用稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 ul/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育90分鐘。

3.?提前20分鐘準(zhǔn)備生物素化抗體工作液。

4.?洗板5次。

5.?空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液 (100 ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育60分鐘。

6.?提前20分鐘準(zhǔn)備酶結(jié)合物工作液。避光室溫(22~25℃)放置。

7.?洗板5次。

8.?空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液(100 ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱，避光孵有30分鐘。

9.?打開(kāi)酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測(cè)程序。

10.?洗板5次。

11.?加入顯色底物(TMB)100 ul/孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育15分鐘。

12.?加入反應(yīng)終止液100 ul/孔，混勻后即刻測(cè)量OD450(3分鐘內(nèi))。在儀器保存讀數(shù)結(jié)果并打印一份紙質(zhì)結(jié)果。

結(jié)果判斷:

1、每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去空白孔的OD值。

2. 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，手工繪制或用軟件繪制并選取最佳擬合曲線，推薦使用二次多項(xiàng)式方程擬合。通過(guò)標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

3、若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后亞測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

2.10 統(tǒng)計(jì)分析

所有的數(shù)據(jù)均以三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用Student’s t檢驗(yàn)和Graphpad Prism 8.0軟件計(jì)算統(tǒng)計(jì)差異。P值<0.05表明有顯著差異。顯著差異為*P<0.05，**P<0.01、***P<0.001和****P<0.0001。